论文摘要
自从青霉素被发现并应用于临床后,抗生素为人类解除细菌性感染发挥了巨大的作用。但随着抗生素在临床上的广泛使用,各种耐药菌不断出现,细菌的耐药性问题逐渐成为关注的热点及研究的难点。糖肽类抗生素,尤其以万古霉素和替考拉宁为代表的抗生素,有效地解决了细菌耐药问题,成为抗耐药性感染的最后一道防线。替考拉宁（teicoplanin）是Parenti等人于1978年在游动放线菌发酵产物中发现的一种糖肽类抗生素,它是继万古霉素之后用于治疗多重耐药菌感染的重要抗生素之一。替考拉宁的分子结构、抗菌谱、抗菌活性均与万古霉素相似。它是由一组化学结构非常相似的化合物组成的抗生素混合物,其主要成分为:TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5、TA3-1等。由于替考拉宁分子结构上增加了脂肪酸侧链,相对分子质量增大,脂溶性增高,在药物代谢动力学上显示了良好特性。越来越多的证据表明,在治疗革兰氏阳性菌感染方面,替考拉宁比万古霉素更具有优势。目的:建立替考拉宁的高效毛细管电泳分离方法并对其进行定量分析;建立替考拉宁的高效液相色谱分析方法并对其进行定量分析;应用液质联用法（LC-MS）对替考拉宁进行定性和定量分析。方法:1.高效毛细管电泳法。（1）通过表面活性剂的浓度、缓冲液浓度及pH、温度及电压的优化,选择最佳的高效毛细管电泳分离条件,对建立的方法进行方法学验证。（2）系统适用性试验:在已确定的高效毛细管电泳条件下,以组分TA2-2考察系统理论板数,并考察相邻组分TA2-4与TA2-5的分离度。（3）精密度试验:取一份对照品溶液,重复进样6次,记录峰面积,计算峰面积的RSD值。（4）检测限的确定:将替考拉宁对照品溶液逐步稀释,测量最高噪音峰的峰高,使样品峰高为噪音峰高的3倍,此时对应的替考拉宁的量即为最低检测限。（5）样品测定:对三批替考拉宁样品按照已确定的分离条件进行测定。2.快速高效液相色谱法。（1）色谱条件的选择:选择不同流动相的组成、配比、流速及柱温,确定最佳的色谱分离条件。（2）系统适用性试验:在已确定的高效液相色谱条件下,以组分TA2-2考察系统理论板数,并考察与相邻组分TA2-3的分离度。（3）专属性试验:在合适的条件下,对替考拉宁样品进行热、碱、酸、氧化、光、湿的破坏。（4）精密度试验:取一份对照品溶液,重复进样6次,记录峰面积,计算峰面积的RSD值。（5）稳定性试验:取替考拉宁供试品溶液适量,室温下放置,分别于0、2、4、6、8、12小时,取样注入液相色谱仪,记录色谱图,计算峰面积的RSD值。（6）线性与范围:配制一系列浓度的替考拉宁对照品溶液,测定峰面积;以浓度为横坐标,以各个峰相应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。（7）最低检测限的确定:将替考拉宁对照品溶液逐步稀释,使峰高为噪音峰高的3倍,此时对应的替考拉宁的量即为最低检测限。（8）样品测定:对三批替考拉宁样品按照已确定的色谱分离条件进行测定。3.液质联用法。（1）替考拉宁的一级质谱分析方法:采用高效液相色谱-电喷雾-四极杆质谱仪,通过质谱参数的优化选择,建立分析测定替考拉宁中主要组分的方法。（2）替考拉宁的二级质谱分析方法:采用高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪,通过质谱参数的优化选择,采用母离子和子离子方式检测,建立分析替考拉宁中主要组分的方法.结果:1.高效毛细管电泳法。（1）最佳的高效毛细管电泳分离条件为:未涂层石英毛细管67cm×50μm（有效长度60cm）;缓冲液为40mmol·L-1硼砂缓冲液（含3.3%SDS,10mmol·L-1磷酸二氢钠,用硼酸调节PH 9.35）;检测波长为214nm;电压为30kV;温度为30℃;在此条件下,替考拉宁的主要组分均获得了基线分离。（2）系统适用性:理论板数按组分A2-2计算为170000,组分TA2-4与TA2-5分离度大于1.5。（3）精密度:按上述条件平行测定6次,组分TA3-1、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5各自峰面积的RSD分别为3.0%、1.7%、0.7%、1.3%、0.7%、0.8%,表明方法精密度良好。（4）最低检测限:以信噪比S/N=3为指标,测得本方法的最低检测限为0.2%。（5）样品测定结果:三批替考拉宁样品在已确定的分离条件下进行了测定,测得组分TA2-2的含量分别63.5%,65.1%,60.2%。2.快速高效液相色谱法。（ 1 ）色谱条件:色谱柱: HALOTM-C18色谱柱（4.6×50mm,2.7μm Agt公司）;流动相:A相为15mmol/L乙酸铵（PH 6.0）;B相为乙腈;流速为1.0ml/min;在0-0.5min:B相由18%到23%,在0.5-6min:B相由23%到23%,在6-6.5min:B相由23%到18%,线性梯度。柱温30℃。检测波长为214nm,进样量为20μl。（2）系统适用性试验:理论板数按组分TA2-2计算为23000,组分TA2-2与TA2-3分离度为1.7。（3）专属性试验:替考拉宁样品进行热、碱、酸、氧化、光、湿破坏,破坏的产物可与主要组分峰基线分离,表明该方法专属性良好。（4）精密度:按上述条件平行测定6次,组分TA3-1、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5各自峰面积的RSD分别为1.1%,0.48%,0.95%,0.77%,0.44%,0.89%表明方法精密度良好。（5）溶液稳定性:取替考拉宁供试品溶液适量,室温下放置,分别于0、2、4、6、8、12小时,取20μl注入液相色谱仪,记录色谱图,组分TA3-1、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5各自峰面积的RSD分别为0.58%、0.88%、0.79%、0.68%、0.82%、0.98%,表明样品溶液在12 h内稳定。（6）线性与范围:替考拉宁浓度在0.025-0.40mg/ml范围内与峰面积呈良好的线性,组分TA2-2的线性方程为y = 8.949×107x– 2400,相关系数r为0.9998。（7）最低检测限:以信噪比S/N=3为指标,测得本方法的最低检测量为0.8ng/ml,最低检测限为0.02%。（8）样品测定:三批替考拉宁样品进行了测定,测得组分TA2-2的含量分别62.7%、63.1%、59.3%。3.液质联用法。（1）一级质谱分析。LC-MS条件为:单级四极杆质谱,电喷雾电离源（ESI）,正离子检测,电离电压3.0KV;锥孔电压30V;电喷雾接口干燥器（N2）流速280L/h,离子源温度115℃;脱溶剂气温度250℃。组分TA3-1、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4和TA2-5的分子离子峰分别为M/Z 1563、M/Z 1877、M/Z 1879、M/Z 1879、M/Z 1893和M/Z 1893。（2）二级质谱分析。LC-MS-MS条件为:三重四极杆质谱,采用正离子模式,离子源温度设为105℃,离子源电离电压为3300V,雾化气流速为500L·hr-1。采集用母离子和子离子检测方式。组分TA2-1的母离子为M/Z 1877,产生的子离子为M/Z 1197和M/Z 314;组分TA2-2和TA2-3的母离子为M/Z 1879,产生的子离子为M/Z 1181和M/Z 316;组分TA2-4和TA2-5的母离子为M/Z 1893,产生的子离子为M/Z 1198和M/Z 330。结论:本文建立了分析测定替考拉宁的高效毛细管电泳法、快速高效液相色谱法和液质联用法,并对新方法进行了方法学验证,对替考拉宁中各主要组分进行了测定。为该药的稳定性研究、质量控制提供了理论依据和技术支持。
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