对虾Rab GTPase在抗病毒免疫中的作用以及对虾白斑综合症病毒（WSSV）膜蛋白与对虾蛋白的互作研究

论文摘要

对虾白斑综合症病毒（WSSV）是危害养殖对虾的最主要病原,其致病能力强,传播范围广,给世界对虾养殖业造成了巨大的损失,然而至今仍无有效的防治方法。本论文开展了对虾免疫信号因子Rab蛋白在对虾免疫过程中的作用机理研究,同时探索WSSV病毒膜蛋白在感染过程中的作用,从病毒和宿主两方面入手,为建立有效的防治方法提供科学依据。通过3’RACE和5’RACE获得对虾Rab基因（命名为PjRab）的cDNA全长,其ORF为636bp,编码212个氨基酸。序列分析发现,PjRab具备Rab蛋白的基本特征,但在C-端与已知的Rab蛋白不同,可能是一种新的Rab蛋白,这是首次在海洋无脊椎动物体内克隆到该基因。对该基因进行了原核表达,并得到了有活性的表达产物。RT-PCR和Western blot分析发现,PjRab在对虾组织中均有转录和翻译。Real-time PCR分析发现,在受到病毒刺激后PjRab基因表达上调,说明PjRab参与了对虾的免疫过程。通过GST-pull down、质谱等方法,发现PjRab蛋白与肌动蛋白（actin）、原肌球蛋白（tropmoyosin）以及对虾白斑综合症病毒的膜蛋白VP466之间存在互作。体外和体内试验证明,PjRab与actin之间存在相互作用。采用抗体抑制Rab蛋白、RNAi抑制Rab基因表达、体外注射mRNA等方法,结果都证明Rab参与了血细胞的吞噬过程。因此,Rab蛋白参与抗病毒免疫的一条可能途径是,通过与actin的互作,调控血细胞的吞噬活性。这是动物中首次发现这一新途径,我们的研究结果拓展了对小G蛋白在免疫反应中的作用的认识。采用抗体中和试验发现,WSSV被VP28、VP68、VP281和VP466的抗体中和后能延缓对虾的死亡,PCR进一步证实了这一结果。因此,这4种病毒膜蛋白在WSSV的感染过程中起重要作用。为了进一步了解膜蛋白的作用,选择VP466进行研究。通过FITC标记、GST pull-down、质谱分析,发现了VP466的互作因子——ATP合成酶。克隆了对虾ATP合成酶基因的完整阅读框,该基因ORF含有1431bp,编码477个氨基酸。昆虫细胞内的互作试验表明,VP466与ATP合成酶存在相互作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 对虾养殖概况
• 1.2 WSSV 研究现状
• 1.2.1 WSSV 基本特征
• 1.2.2 WSSV 功能基因研究
• 1.3 对虾的免疫系统
• 1.3.1 免疫器官
• 1.3.2 免疫细胞
• 1.3.3 对虾的免疫机理
• 1.4 Rab GTPase 的基本特征与研究进展
• 1.4.1 Rab 蛋白的种类与进化
• 1.4.2 Rab 蛋白的结构
• 1.4.3 Rab 蛋白的循环
• 1.4.4 Rab 蛋白的功能
• 1.5 本论文研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验用动物、细胞、菌株和质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 常用溶液和培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 对虾 Rab 基因全长cDNA 的克隆
• 2.2.2 对虾 Rab 基因的重组表达和蛋白质纯化
• 2.2.3 GTP 结合试验
• 2.2.4 多克隆抗体制备
• 2.2.5 抗血清的纯化
• 2.2.6 酶联免疫分析（ELISA）
• 2.2.7 对虾 Rab 基因在对虾体内的转录、翻译分析
• 2.2.8 对虾 Rab 基因表达与病毒刺激的关系
• 2.2.9 对虾 Rab 蛋白互作分析
• 2.2.10 对虾 Rab 与对虾免疫的关系研究
• 2.2.11 WSSV 膜蛋白在病毒感染过程中的作用
• 2.2.12 WSSV 膜蛋白VP466 与对虾蛋白的互作研究
• 3 结果与分析
• 3.1 对虾 Rab GTPase 在抗病毒免疫中的作用
• 3.1.1 对虾 Rab 基因的基本性质
• 3.1.1.1 Rab 基因的结构
• 3.1.1.2 PjRab 基因的重组表达和抗体制备
• 3.1.1.3 PjRab 蛋白的 GTP 结合活性分析
• 3.1.1.4 PjRab 基因在对虾体内的转录表达分析
• 3.1.1.5 PjRab 蛋白的定位分析
• 3.1.2 对虾 Rab GTPase 与病毒刺激的关系
• 3.1.3 对虾 Rab GTPase 在抗病毒免疫中的作用
• 3.1.3.1 对虾体内与 PjRab 互作的蛋白分析
• 3.1.3.2 对虾 Rab 与actin 的蛋白互作分析
• 3.1.3.3 对虾Rab GTPase对血细胞吞噬功能的影响
• 3.2 WSSV 膜蛋白与对虾蛋白的互作研究
• 3.2.1 抗体制备
• 3.2.1.1 WSSV病毒粒子的纯化
• 3.2.1.2 重组表达 WSSV 膜蛋白的纯化
• 3.2.1.3 抗体制备
• 3.2.2 抗体中和试验
• 3.2.2.1 对虾 WSSV 病毒感染试验
• 3.2.2.2 抗体中和试验
• 3.2.3 对虾体内与WSSV VP466互作的蛋白分析
• 3.2.3.1 VP466 蛋白与对虾血细胞的结合
• 3.2.3.2 GST pull－down试验
• 3.2.3.3 蛋白质的质谱分析
• 3.2.4 VP466 与对虾ATP 合成酶（ASS）的互作
• 3.2.4.1 对虾ATP 合成酶基因的cDNA 克隆
• 3.2.4.2 昆虫细胞内验证 VP466 与 ASS 的互作
• 4 讨论
• 5 结论与展望
• 结论:
• 展望:
• 参考文献
• 附录
• 致谢