论文摘要
Cajal细胞（Interstitial cells of Cajal, ICCs）作为一种特殊的间质细胞,以细胞网络的形式分布于整个胃肠道。近二十余年,国内外学者通过对胃肠壁内ICCs的形态特征、超微结构、起源及生理功能等一系列研究表明:ICCs具有产生自发性电慢波、参与神经信息整合与传递等功能,对胃肠平滑肌运动具有重要调节作用。近年的临床研究发现ICCs数量减少与一些胃肠运动功能障碍性疾病:例如糖尿病胃轻瘫、慢传输型便秘、Crohn’s病、术后胃肠运动功能障碍等密切相关。尽管上述疾病的发生机制尚不清楚,但均有一个共同的病理变化:即病变部位胃肠壁内ICCs数量呈不同程度减少,甚至缺如,ICCs彼此间及其与平滑肌细胞间不能形成完整的细胞网络。但因对上述疾病的发病机理及ICCs减少、细胞网络完整性被破坏的原因等尚不清楚,一直是临床治疗的难题。设想如果能够阐明促进ICCs细胞网络完整性恢复的调控机制,势必为临床相关疾病的治疗提供有益的思路。ICCs表达c-kit基因产物,一种原癌基因编码的受体酪氨酸激酶（Kit）。它的配体是干细胞因子（stem cell factor,SCF）,由平滑肌和神经产生。在Kit或SCF基因突变的小鼠和大鼠,以及用Kit中和性抗体或Kit受体阻断剂在胚胎晚期或生后早期阻断Kit受体功能,将引起ICCs数量明显减少或丢失,伴有胃肠运动功能障碍,表明胚胎期ICCs的发育、存活及形态的维持需要Kit/SCF信号通路功能的正常。体外研究亦发现,在外源性SCF的作用下,培养的小鼠小肠ICCs具有一定的增殖能力,但这种增殖仅见于生后6天前的新生鼠,提示ICCs的增殖具有时间依赖性和SCF依赖性。我们的研究发现,小肠半横断吻合术后,吻合部位丢失的ICCs随时间的经过能够逐渐恢复正常的数量和分布模式,提示成年动物ICCs仍具有一定的增殖能力,且与平滑肌表达SCF有关,提示Kit/SCF信号通路可能参与了这一过程。已知成年哺乳动物胃肠壁内ICCs持续表达c-kit及其产物KIT蛋白,KIT/SCF信号通路对发育成熟的ICCs是否具有与胚胎期相似的作用尚不清楚。抑制成年哺乳动物Kit信号通路后,ICCs是否减少?发生凋亡或者转分化?丢失后能否恢复正常分布?在此过程中Kit/SCF信号通路的作用如何均亟待阐明。此外,肠梗阻等胃肠运动功能障碍性疾病ICCs丢失后能否恢复正常分布以及Kit/SCF信号通路的是否参与这一过程的调节均不清楚。因此,探讨Kit/SCF信号通路对成熟ICCs可塑性的调控机制将有利于理解胃肠运动功能障碍性疾病的发病机制,同时为临床相关疾病的治疗开辟新的策略。本实验分为两个部分:第一部分:Imatinib是Kit受体的特异性抑制剂。本研究给成年小鼠和豚鼠连续口服Imatinib,利用Kit和Vimentin免疫荧光染色观察阻断Kit信号通路后,ICCs的数量和突起长度的变化,同时Kit/a-SMA双重免疫荧光标记观察ICCs是否向平滑肌表型转分化,以及体外灌流观察小肠功能变化;停Imatinib处理后观察ICCs恢复情况以及小肠功能变化,并用Kit/PCNA和Kit/BrdU双重染色对各实验组ICCs的增殖进行分析。主要结果如下:1、Imatinib处理后,成年豚鼠和小鼠小肠的ICCs数量逐渐减少,随时间的延长尤为明显,最多可减少1/2以上,同时自主节律性运动功能亦受到抑制。2、ICCs数量减少的同时,可见Kit/a-SMA双标阳性ICC和Kit（-）/a-SMA（+）ICC样细胞,提示ICCs可能向平滑肌的表型转分化,但未见ICC出现凋亡。3、停止Imatinib处理后,ICCs数量和功能逐渐恢复正常,与此同时可见大量的BrdU/Kit和PCNA/Kit双标阳性的细胞。上述结果表明成年哺乳动物ICCs具有较强的可塑性,Kit信号通路对成熟ICCs的存活和增殖具有重要的调控作用,该信号通路功能障碍可能导致ICCs的发生转分化,成熟ICCs具有较强的增殖能力。第二部分:制作小肠机械性肠梗阻模型,采用Kit及Kit/a-SMA单/双重免疫荧光染色观察梗阻期间和解除梗阻后ICCs的数量变化,Western Blot检测SCF和Kit磷酸化（p-Kit）的变化,用Kit/BrdU双重染色显示成熟ICCs的增殖以及体外灌流检测小肠运动功能变化,探讨ICCs的数量变化与SCF表达及Kit信号通路激活或抑制的相关性。主要结果如下:1、梗阻期ICCs数量逐渐减少,梗阻14天靠近梗阻部位最明显,并可见Kit/a-SMA双标阳性细胞,同时肠运动功能亦受到明显的抑制;2、在梗阻期SCF表达量和p-Kit均下降,靠近吻合口部位最明显,约为正常的1/2到1/3,解除梗阻后,SCF和p-Kit恢复正常。3、解除梗阻后,ICCs数量增加,逐渐恢复正常分布模式同时可见大量BrdU/Kit双标阳性细胞,与此同时小肠运动功能也恢复正常。上述结果表明SCF表达的变化与Kit信号通路的抑制和激活密切相关,同时Kit信号通路对成熟ICCs的存活、表型维持以及增殖等可塑性具有重要调节作用。综上所述,本研究初步证明了成熟ICCs具有较强的可塑性,这种可塑性与Kit/SCF信号通路密切相关;Kit活性被抑制后ICCs可能向平滑肌的表型转分化;解除抑制后,ICCs能够恢复正常的数量和分布模式,其数量的增加与ICCs的增殖有关;肠梗阻时,ICCs数量的减少和解除梗阻后数量的增加与平滑肌表达SCF的变化平行,提示胃肠运动功能障碍性疾病可能与平滑肌表达的SCF不足, Kit信号通路活性低下有关。靶向性提高SCF的表达或直接激活Kit信号通路可能是临床治疗相关疾病的策略之一。
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