剪切力作用下红豆杉细胞一氧化氮和MAPK调控模型的动态特征

论文摘要

为了研究剪切力对红豆杉细胞一氧化氮（NO）和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的影响,在膜式Couette反应器中悬浮培养东北红豆杉细胞,研究了剪切力作用下细胞内NO和氧化还原态的变化、H2O2和MAPK调控模型的稳定性,试图从调控模型的稳定性角度分析细胞信号的动态特征。研究了剪切力作用下红豆杉细胞中NO的变化及其作用。实验发现剪切力作用下红豆杉细胞中NO的浓度在5h达到最大,NO和SNP等氮氧化物抑制了红豆杉细胞谷胱苷肽转硫酶（GST）的活性,GST活性降低有利于保持细胞内GSH的含量和延缓细胞内微环境趋于氧化态。用活性氧的代谢模型定量地分析了NADPH在抗坏血酸-谷胱苷肽（ASC-GSH）循环和活性氧清除中的作用,结果表明细胞内的ASC和GSH被用于清除活性氧,NADPH是维持ASC-GSH循环所必须的还原剂,NADPH缺乏引起细胞内ASC、GSH氧化和细胞内H2O2的浓度增大。引入比例、积分和微分调节概念,把H2O2的产生和清除过程分别看作信号的比例放大和积分或微分反馈调节过程,用Simulink模拟了不同调控模型中H2O2的动态特征,结果显示积分负反馈调节模型与H2O2的实验结果相吻合。探讨了MAPK调控模型的稳定性,负反馈Huang-Ferrell模型和Kholodenko模型是一致的,两种模型都存在双稳态区和磷酸化MAPK的振荡区,增大MAPK浓度或磷酸化速率都能引起负反馈Huang-Ferrell模型中MAPK的振荡。激发MAPKKK磷酸化的酶E1的周期性变化也能产生与上述两种模型类似的振荡特征。多分辨分析方法能在二维空间上区分不同条件下H2O2和磷酸化MAPK的动态差别。对比了传统式和膜式Couette剪切反应器中溶解氧的差异,结果表明膜式反应器中能维持较高的溶解氧,在相同的实验条件下,膜式反应器中的细胞活力较高。通过考察剪切力作用下红豆杉细胞壁和细胞壁蛋白的变化,发现活性氧引起胶质的交联反应和蛋白表达的差异,随着剪切力时间延长,交联反应程度和细胞壁中蛋白质分子总的无规则卷曲程度都增加,同时细胞壁中WAK1的表达也增加。用主成分聚类法分析了剪切力作用前后细胞壁的差异,发现剪切力作用8h后,细胞壁的差异才明显。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物细胞的剪切敏感性
• 1.1.1 研究植物细胞剪切敏感性的装置
• 1.1.2 剪切力对植物细胞的影响
• 1.1.3 植物细胞剪切敏感性的差异
• 1.1.4 剪切力作用下红豆杉细胞氧迸发的生物学模型
• 1.2 力信号在植物细胞中的转导
• 1.2.1 力信号的转导途径
• 1.2.2 细胞壁在力信号转导中的作用
• 1.2.3 细胞膜在力信号转导中的作用
• 1.2.4 细胞骨架在力信号转导中的作用
• 1.3 植物细胞对逆境胁迫的响应
• 1.3.1 活性氧和细胞的氧化还原态
• 1.3.2 一氧化氮在逆境胁迫中的信号转导
• 1.3.3 环境胁迫下植物细胞壁的防御反应
• 1.3.4 蛋白激酶的激活
• 1.4 细胞内信号动态变化的模型
• 1.5 细胞内信号调控的拓扑结构
• 1.6 本文研究意义及主要研究内容
• 第二章 膜式Couette 反应器中的培养环境
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 细胞株系及其培养
• 2.1.2 Couette 反应器
• 2.1.3 细胞活力测定
• 2.1.4 细胞膜通透性测定
• 2.1.5 溶解氧测定
• 2.1.6 细胞密度的测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 红豆杉细胞的氧消耗速率
• 2.2.2 Couette 反应器中红豆杉细胞的氧消耗模型
• 2.2.3 不同反应器中细胞的活力和膜通透性
• 2.2.4 Couette 反应器中细胞的沉降
• 2.3 小结
• 第三章 剪切力对细胞壁的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞壁的提取及FTIR光谱检测
• 3.1.2 细胞壁蛋白二维结构变化的测定
• 3.1.3 细胞壁中蛋白表达的测定
• 3.1.3.1 细胞壁中蛋白的提取
• 3.1.3.2 细胞壁相连蛋白激酶的测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 剪切过程中细胞壁的变化
• 3.2.2 不同生长时期的东北红豆杉细胞壁的差异
• 3.2.3 活性氧对胶质酯键吸收的影响
• 3.2.4 剪切力对细胞壁蛋白质的影响
• 3.2.4.1 剪切力对细胞壁蛋白质二级结构的影响
• 3.2.4.2 剪切作用下细胞壁蛋白的差异
• 3.2.4.3 剪切作用下细胞壁相连蛋白激酶（WAK）的表达
• 3.3 小结
• 第四章 剪切力诱发一氧化氮产生并抑制谷胱苷肽转硫酶
• 4.1 材料与方法
• 2^-测定'>4.1.1 NO₂^-测定
• 4.1.2 NO测定
• 4.1.3 一氧化氮合成酶测定
• 4.1.4 谷胱甘肽转硫酶活性测定
• 4.1.5 3-硝基酪氨酸测定
• 4.1.6 细胞膜通透性的测定
• 4.1.7 胞内丙二醛含量的测定
• 4.1.8 数据统计分析
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 剪切力诱导东北红豆杉细胞产生NO
• 4.2.2 类一氧化氮合成酶（NOS）产生NO
• 4.2.3 活性氧和NO的相互作用对细胞的影响
• 4.2.4 氮氧化物抑制谷胱甘肽转硫酶
• 4.2.5 剪切力对细胞 3-硝基酪氨酸浓度的影响
• 4.3 小结
• 第五章 细胞氧化还原态及活性氧的代谢分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 细胞内酶的提取
• 5.1.2 过氧化物酶（APX）测定
• 5.1.3 谷胱甘肽还原酶（GR）和转硫酶（GST）测定
• 5.1.4 抗坏血酸和脱氢抗坏血酸测定
• 5.1.5 谷胱甘肽测定
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 东北红豆杉细胞氧化还原态的变化
• 5.2.2 剪切力对东北红豆杉细胞抗氧化酶的影响
• 5.2.3 活性氧代谢分析
• 5.2.3.1 活性氧的酶和非酶清除
• 5.2.3.2 抗氧化酶活性变化对氧化还原态的影响
• 5.2.3.3 细胞内GSH和ASC对细胞氧化还原态的影响
• 5.3 小结
• 第六章 不同生长时期的红豆杉细胞剪切敏感性的差异
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 过氧化氢测量
• 6.1.2 培养液pH的测定
• 6.1.3 ERK的测定
• 6.1.4 细胞膜的提取
• +-ATPase 测定'>6.1.5 H⁺-ATPase 测定
• 6.1.6 细胞膜流动性测定
• 6.2 结果与讨论
• +-ATPase对细胞外液pH的影响'>6.2.1 H⁺-ATPase对细胞外液pH的影响
• 6.2.2 膜流动性改变剂对细胞的影响
• 6.2.3 ERK表达的差异
• 6.3 小结
• 第七章 活性氧和蛋白激酶的动态特征与识别
• 7.1 材料与方法
• 7.2 结果与讨论
• 2O₂的反馈调节'>7.2.1 H₂O₂的反馈调节
• 7.2.2 蛋白激酶调节模型的动态特征及稳定性
• 7.2.2.1 Huang-Ferrell模型的动态特征
• 7.2.2.2 负反馈Huang-Ferrell模型的动态特征
• 7.2.2.3 Kholodenko模型的动态特性及稳定征
• 7.2.3 信号动态特征的多分辨分析
• 7.2.3.1 剪切力作用下活性氧的多分辨分析
• 7.2.3.2 蛋白激酶的多分辨分析
• 7.2.3.3 多分辨分析与主成分分析的差异
• 7.3 小结
• 第八章 结论与展望
• 8.1 结论
• 8.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 附录
• 致谢