维生素E聚乙二醇琥珀酸酯乳化的（乳酸-羟基乙酸）共聚物多功能纳米粒逆转肺癌细胞多药耐药的研究

论文摘要

背景7-乙基-10-羟基-喜树碱（SN-38）是抗癌药伊立替康在人体内的活性代谢产物,其抗癌效果是前药伊立替康的100-1000倍。然而,SN-38在肝脏里的代谢转化率还不足10%。同时又因其水不溶性及各种药剂溶液难溶解性、低的生物利用度和极不稳定性,限制了它作为抗癌一线药物的可能性。因此,研究并开发一种高效稳定的递药系统来运载SN-38并保持其抗癌活性是一项重大的任务。聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（Poly （lactic-co-glycolic acid）, PLGA）由乳酸和羟基乙酸两种单体随机聚合而成,是一种可降解的功能高分子有机化合物,具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能,在生物医学工程领域有广泛的用途。目前已被制作为人工导管,药物缓释载体,组织工程支架材料等。生育酚聚乙二醇琥珀酸盐（TPGS）是一种高效的乳化剂,其乳化效果是普通乳化剂PVA的几十倍,并且TPGS是一种十分优秀的药用辅料,可以在制剂学中得到广泛的应用,常被用作P-糖蛋白外排泵的抑制剂,但其抑制P-糖蛋白的作用机理尚未明确。实验目的本课题以生物可降解型高分子材料聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物为载体,生育酚聚乙二醇琥珀酸盐为乳化剂,采用复乳化溶剂挥发技术制备载有SN-38的纳米颗粒,对其进行理化性质的考察,并研究该纳米颗粒在体外对耐药细胞株的抗癌活力,同时观察纳米颗粒的入胞情况以及分析纳米颗粒载体的逆转多药耐药的机理。实验方法1.制备表征：采用乳化溶剂挥发技术制备纳米粒后,采用红外光谱、差式扫描量热仪、X射线衍射和扫描电镜对包合物进行了理化结构、形态学和粒径的检测；利用紫外分光光度计测定了纳米颗粒的包封率和载药率；同时,对纳米颗粒体外释放特征进行了考察。2.生物效应：采用WST-1方法分别测定载体材料TPGS、PLGA、TPGS/PLGA NPs对A549和A549/DDP细胞的毒性。采用WST-1方法分别测定游离的SN-38和TPGS/PLGA/SN-38 NPs对两种细胞的细胞毒性,并计算出IC50值。3.机理：摄取制备6-香豆素标记的纳米粒即TPGS/PLGA/C6 NPs,采用多种纳米粒入胞途径抑制剂处理细胞,采用共聚焦显微镜观察的方法,观察6-香豆素入胞的实时效果,并且以细胞内积累的游离的6-香豆素和纳米颗粒内的6-香豆素对比,研究本课题制备的纳米粒进入细胞的途径和机理。4.机理：外排用FITC-UIC2抗体标记法选择出耐药株细胞,并进行体外TPGS/PLGA NPs逆转多药耐药的机制研究。采用共聚焦显微镜观察的方法,罗丹明123（R-123）作为外排模式分子,制备R-123标记的纳米粒即TPGS/PLGA/R-123 NPs,以各种外排抑制剂和空纳米颗粒载体处理细胞来研究纳米颗粒抑制外排的机制。实验结果1.本课题制备的SN-38纳米颗粒呈球形、表面光滑,粒径分布200 nm左右,分散性好,载药率为9.86%,包封率为97.6%,明显比普通乳化剂制备的颗粒的6.97%和82.5%高出了很多。SN-38在TPGS/PLGA纳米颗粒内保持了良好的药理活性和稳定性。SN-38从TPGS/PLGA/SN-38 NPs释放动力学表明呈现二次释放模式,减缓了突释行为并延长了药物释放时间,累计释放量比PLGA/SN-38NPs释放量大,且两者在酸性环境中的释放速度和释放量都高于中性环境。2.材料的体外毒性试验表明材料本身对细胞无毒性作用。载入TPGS/PLGA NPs的SN-38比游离的SN-38对耐药株细胞的毒性提高了3.56倍。3.通过共聚焦显微镜对细胞吸收的实时观察,我们可以得出结论TPGS/PLGA /SN-38 NPs是以小窝蛋白介导的胞吞作用进入细胞的,逃逸了多药耐药细胞膜的P-糖蛋白外排泵的识别,提高了药物的吸收作用。4. 通过共聚焦显微镜对细胞外排实验的观察,入胞的纳米粒把药物释放出后,递药载体材料干扰了外排微环境,比如线粒体或者P-糖蛋白领域的ATP-结合位点。从而使细胞内积累的药物浓度更大,最重要的一点是本课题以药理无活性的辅料作为P-糖蛋白的逆转剂而非有药理活性的抑制剂,取得了很好的效果。结论本课题制备的纳米颗粒能够显著提高SN-38的溶解性和药理稳定性,提高其抗癌效力,同时递药载体TPGS/PLGA NPs为喜树碱这类难溶解不稳定且是P-糖蛋白底物的药物提供了一种可靠安全的递药系统。这些结果也为开发安全辅料运用于纳米颗粒提供了可靠的信息。

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摘要

Abstract

第一部分文献综述

第一章喜树碱类药物的研究进展

1 喜树碱及喜树碱衍生物

1.1 10—羟基喜树碱（10—Hydroxycam—potothecine,HCPT）

1.2 伊立替康（irinotecan,CPT-11）

1.3 拓扑替康（topotecan,TPT）

2 CPT-11的活性代谢产物SN-38的研究进展

2.1 SN-38的理化性质

2.2 SN-38的药理应用

2.3 SN-38的药代动力学

3 喜树碱类药物的抗癌作用机制

第二章多药耐药产生的相关机制及其逆转策略的研究进展

1 多药耐药（MDR）及产生MDR的机制

2 P-糖蛋白介导的MDR的结构及功能

2.1 P-gp的结构

2.2 P-gp的功能特点

2.3 P-gp介导的MDR机制

3 多药耐药逆转的研究进展

3.1 化学药物及天然药物的逆转剂研究

3.2 免疫治疗

3.3 基因治疗

3.4 纳米粒递药系统在逆转肿瘤多药耐药性中的应用

3.4.1 非修饰的纳米粒递药系统

3.4.2 修饰的纳米粒递药系统

3.4.3 多功能纳米粒递药系统

第三章聚（乳酸-羟基乙酸）PLGA纳米粒的研究进展

1 聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物的结构和性质

2 PLGA纳米粒的制备最新研究进展

2.1 溶剂挥发法

2.2 喷雾干燥法

2.3 相分离法

3 PLGA纳米粒的临床应用

3.1 获得长效免疫疫苗

3.2 抗肿瘤治疗

3.3 细胞支架

3.4 免疫抑制

4 PLGA纳米粒缺点及其应对策略研究进展

4.1 药物突释及应对

4.2 药物不稳定性及改善

4.3 载药纳米粒的包封率和载药率低及其提高

第四章聚乙二醇1000维生素E（TPGS）琥珀酸酯在递药领域的应用进展

1 TPGS的结构及理化性质

2 TPGS的应用研究

2.1 TPGS作为型乳化剂和增溶剂

2.2 TPGS作为纳米粒载体材料

2.3 TPGS作为P-gp介导的多药耐药抑制剂

3 TPGS抑制P-gp的机理研究

第五章 SN-38递药系统的研究进展

1 SN-38纳米粒

2 SN-38脂质体

3 SN-38聚合物胶束

第二部分实验研究

第一章 TPGS/PLGA/SN-38 NPs的制备及其表征

1 前言

2 实验材料

2.1 实验试剂

2.2 实验仪器

3 实验方法

3.1 纳米颗粒的制备

3.2 纳米颗粒理化性质的测定

3.2.1 扫描电镜

3.2.2 动态光散射

3.2.3 X射线衍射

3.2.4 热分析

3.2.5 傅立叶红外光谱鉴定

3.2.6 Zeta电位测量

3.3 包封率和载药率的测定

3.3.1 标准曲线的制定

3.3.2 样品测定

3.3.3 体外释放动力学研究

3.4 统计学处理

4 结果

4.1.1 纳米颗粒的制备结果及粒径分布

4.1.2 X射线衍射

4.1.3 热谱图分析研究

4.1.4 傅立叶红外光谱鉴定

4.1.5 Zeta电位分析

4.2 包封率和载药率的测定

4.3 体外释放动力学研究

5 讨论

第二章 TPGS/PLGA/SN-38 NPs的体外药效学研究

1 前言

2 实验材料

2.1 实验试剂

2.2 实验仪器

3 实验方法

3.1 A549cells和A549/DDPcells的培养

3.2 A549 cells和A549/DDPcells的P-gp过表达鉴定

3.3 药物、材料及空纳米颗粒浓度的制备

3.4 纳米粒的细胞毒性和体外药效学评价

4 结果

4.1 A549细胞和A549/DDP细胞的P-gp过表达

4.2 材料的毒性评价

4.3 SN-38和TPGS/PLGA/SN-38 NPs的体外药效学评价

5 讨论

第三章 TPGS/PLGA/SN-38NPs的吸收及入胞机制的研究

1 前言

2 实验材料

2.1 实验试剂

2.2 实验仪器

3 实验方法

3.1 时间依赖性的细胞内6-香豆素的积累

3.2 吸收机制研究

3.3 统计学处理

4 结果

4.1 时间依赖性的细胞内C6积累量

4.2 纳米颗粒入胞机制研究

5 讨论

第四章 TPGS/PLGA/SN-38NPs对MDR逆转效果及其机制研究

1 前言

2 实验材料

2.1 实验试剂

2.2 实验仪器

3 实验方法

3.1 与P-gp外排有关的胞内纳米颗粒的积累

3.2 TPGS/PLGA NPs对MDR逆转的效果及机制

3.3 统计学处理

4 结果

4.1 TPGS/PLGA NPs对MDR逆转的效果即TPGS/PLGA/C6NPs的积累

4.2 TPGS/PLGA NPs对P-gp介导的多药耐药逆转的机制

5 讨论

小结

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢

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