基于磁球放大技术的电化学发光免疫分析方法及电化学发光共振能量转移

论文摘要

第一章中,我们以Ru（bpy）2（dcbpy）NHS作为ECL标记物,将电化学发光免疫分析法和磁球放大技术相结合,发展了一种超灵敏的检测抗原、抗体的电化学发光检测方法。该法中亚微米磁球表面因为修饰了大量的发光体分子而起到信号放大的作用。实验中我们利用抗体表面的氨基与盖玻片基底上硅烷化后的环氧基的反应将抗体固定在基底表面,然后经免疫反应、生物素与链霉亲和素的特异性反应等最终形成链霉亲和素化的磁球-生物素化的抗体-抗原-抗体双抗夹心式的复合物,然后进行解离。利用Ru（bpy）2（dcbpy）NHS上的酯基与磁球上的链霉亲和素之间的结合反应将ECL标记物标记到磁球表面,实验时将修饰了ECL标记物的磁球用磁铁固定到Au电极表面。在三丙胺存在的条件下进行ECL检测,在1.35 V得到最大的电化学发光强度（Im,ECL）。利用Im,ECL,我们可以实现对抗原的检测。利用链霉亲和素修饰的磁球（SA-SMBs）可以增加单个目标分子对应的Ru（bpy）32+分子的数量,通过信号放大作用,大大提高了Ru（bpy）32+分子的电化学氧化得到的第二个ECL波,从而提高了检测方法的灵敏度。利用这种方法,我们实现了对CEA的检测,线性范围为1.0×10-14 mol／L～3.0×10-13mol／L。第二章中,我们引入电化学发光作为供体光源研究了一种新的共振能量转移体系-电化学发光共振能量转移体系（ECRET）。电化学发光试剂异鲁米诺在过氧化氢存在的条件下,通过电化学反应发出中心波长为460 nm的蓝色光充当能量供体；另外,选择最大发射峰为655 nm的红色荧光量子点作为能量受体。当向电极上施加一电位时,电化学发光供体将能量转移给量子点受体,产生高效的电化学发光共振能量转移。ECRET技术可被应用于研究核酸等生物分子间的相互作用,DNA分析及免疫分析。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 基于磁球放大技术的超灵敏电化学发光免疫分析方法
• 1.1 引言
• 1.2 实验部分
• 1.2.1 实验仪器
• 1.2.2 材料与试剂
• 1.2.3 实验步骤
• 1.2.3.1 载体的硅烷化
• 1.2.3.2 微升级反应池的制作
• 1.2.3.3 保湿盒的制作
• 1.2.3.4 磁球的预处理
• 1.2.3.5 Au片工作电极的制作
• 1.2.3.6 三联吡啶钌的 N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
• 1.2.3.7 双抗夹心免疫反应过程
• 2（dcbpy）NHS修饰'>1.2.3.8 磁球从微孔板上解脱及用Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS修饰
• 2（dcbpy）NHS修饰的磁球在金电极表面的固定'>1.2.3.9 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS修饰的磁球在金电极表面的固定
• 1.2.3.10 ECL法和ECL光谱法检测
• 3Cl₂的检测'>1.2.3.11 Ru（bpy）₃Cl₂的检测
• 2（dcbpy）NHS的检测'>1.2.3.12 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS的检测
• 3²⁺-NHS-SA-SMBs的检测'>1.2.3.13 Ru（bpy）₃²⁺-NHS-SA-SMBs的检测
• 1.3 结果与讨论
• 3²⁺-NHS-SA-SMBs的ECL原理'>1.3.1 Ru（bpy）₃²⁺-NHS-SA-SMBs的ECL原理
• 1.3.2 三联吡啶钌的N-羟琥珀酰亚胺酯的合成
• 1.3.3 链霉亲和素的磁球与抗原比例的选择
• 1.3.4 链霉亲和素的磁球从微反应池底板上解脱
• 2（dcbpy）NHS修饰SA-磁球及其电化学发光'>1.3.5 Ru（bpy）₂（dcbpy）NHS修饰SA-磁球及其电化学发光
• 1.3.6 ECL测定法应用于癌胚抗原的定量检测
• 1.4 结论
• 1.5 参考文献
• 第二章 鲁米诺/过氧化氢-量子点体系的电化学发光共振能量转移及其应用
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 材料与试剂
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 Au片工作电极的制作
• 2.2.3.2 电解池的制作
• 2.2.3.3 量子点复合物的制备
• 2.2.3.3.1 luminol-QD的复合物的制备
• 2.2.3.3.2 QD—DNA复合物的制备
• 2.2.3.3.3 DNA—luminol的复合物的制备
• 2.2.3.3.4 luminol-DNA-QD的复合物的制备
• 2.2.3.3.5 luminol-DNA-DNA-QD的复合物的制备
• 2.2.3.4 QDs、异鲁米诺的荧光猝灭
• 2.2.3.5 电化学发光检测
• 2.2.3.5.1 异鲁米诺的电化学发光
• 2.2.3.5.2 量子点的电化学发光
• 2.2.3.5.3 QD—luminol复合物的电化学发光
• 2.2.3.5.4 Nafion膜固定量子点的电化学发光
• 2.2.3.6 电化学发光光谱的检测
• 2.2.3.6.1 异鲁米诺的电化学光谱
• 2.2.3.6.2 量子点的电化学光谱
• 2.2.3.6.3 电化学发光共振能量转移光谱的检测
• 2.2.3.6.4 DNA杂交物电化学发光共振能量转移光谱的检测
• 2.2.3.7 电化学发光共振能量转移检测DNA杂交反应
• 2.2.3.7.1 电化学发光共振能量转移检测DNA杂交反应[模式1]
• 2.2.3.7.2 电化学发光共振能量转移检测DNA杂交反应[模式2]
• 2.2.3.7.3 电化学发光共振能量转移检测DNA杂交反应[模式3]
• 2.2.3.8 DNA构型转化
• 2.2.3.8.1 电化学发光共振能量转移测定DNA构型转化[模式1]
• 2.2.3.8.2 电化学发光共振能量转移测定DNA构型转化[模式2]
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 异鲁米诺/过氧化氢-量子点电化学发光共振能量转移原理
• 2.3.1.1 异鲁米诺的电化学发光原理
• 2.3.1.2 异鲁米诺/过氧化氢体系的电化学发光原理
• 2O₂-QD电化学发光共振能量转移原理'>2.3.1.3 luminol/H₂O₂-QD电化学发光共振能量转移原理
• 2O₂体系的ECL'>2.3.2 luminol/H₂O₂体系的ECL
• 2.3.3 ECRET条件
• 2.3.3.1 luminol-QD复合物在电极表面的固定
• 2.3.3.2 luminol-QD复合物的电化学发光共振能量转移
• 2.3.3.2.1 不同电位对共振转移发光光谱的影响
• 2O₂浓度对共振转移发光光谱的影响'>2.3.3.2.2 H₂O₂浓度对共振转移发光光谱的影响
• 2.3.4 luminol-DNA-DNA-QD复合物的ECRET
• 2.3.5 ECRET应用
• 2.3.5.1 核酸分子间的相互作用
• 2.3.5.1.1 基于电化学发光共振能量转移检测DNA的反应-模式一
• 2.3.5.1.2 基于电化学发光共振能量转移检测DNA的反应-模式二
• 2.3.5.1.3 基于电化学发光共振能量转移检测DNA的反应-模式三
• 2.3.5.2 判断构型转化
• 2.3.5.2.1 基于电化学发光共振能量转移判断构型转化-[模式1]
• 2.3.5.2.2 基于电化学发光共振能量转移判断构型转化-[模式2]
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表