葡萄砧木PGIP基因的克隆及转化烟草的研究

论文摘要

多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase, PG）是多种病原真菌的致病因子,是病原真菌入侵过程中分泌的第一个细胞壁降解酶。而多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalaeturonase-inhibiting protein, PGIP）是一种特异性细胞壁结合蛋白,富含抗病基因所具有的亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat, LRR）,非竞争性地抑制病原真菌PG酶的活性,减少PG对植物细胞壁的降解,诱导植物的抗病性反应,从而抑制了真菌病害的发生.本实验以’5BB’（Vitis berlandieri×V. riparia）,’1202’（V. vinifera×V. rupestrsis）和’Beta’（V. riparia×V. labrusca）三种葡萄砧木为材料,克隆了‘5BB’、‘1202’和’Beta’PGIP基因,并用生物信息学的方法分析其结构和功能。同时构建了‘5BB’PGIP基因的高效表达载体（pYF7704）,进行了烟草的遗传转化研究。现将主要研究结果汇总如下：1.以葡萄砧木‘5BB’、‘1202’和’Beta’叶片为试材,通过设计特异引物,PCR扩增,从上述砧木基因组中分别得到1条全长1002bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因序列（’5BB’PG/P.基因GenBank的登录号：FJ530941;’1202’PGIP基因GenBank的登录号：GQ139363;’Beta’PGIP;基因GenBank的登录号：GQ139364）。2.对‘5BB’、‘1202’和’Beta’ PGIP.基因序列进行生物信息学分析,结果表明,它们都包含1个完整的开放阅读框；均编码333个氨基酸,蛋白质分子量分别为：37.07Kda、37.09 Kda和37.09 Kda；等电点分别为：8.683、8.684、8.257；疏水性和亲水性分析及信号肽分析表明：第1-27个氨基酸残基是信号肽；序列同源比对结果显示,与欧洲葡萄、其它果树的相应序列同源性分别为99%和68%；其推导的蛋白质序列中包含一段亮氨酸重复序列,三级结构和菜豆PGIP相似。3.将构建好的’5BB’ PGIP基因表达载体（pYF7704）通过农杆菌介导法转化烟草,最终获得102个抗性株系。经过PCR检测,从10株中扩增出了目的条带。进一步的RT-PCR检测结果表明,有5个为阳性株系。初步证实,’5BB’PGIP.基因已经整合到烟草的基因组中。通过对转基因株系与未转基因植株对照植株的SOD和CAT酶的活性检测,发现转’5BB’PGIP基因株系的SOD和CAT酶活性均比对照高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 引言
• 第一章 植物抗病分子机制研究进展
• 1 植物抗病因子
• 1.1 结构因子
• 1.1.1 蜡质
• 1.1.2 胼胝质（callose）
• 1.1.3 木质素（lignin）
• 1.2 生化因子
• 1.2.1 植保素（phytoalexins,PA）
• 1.2.2 活性氧（active oxygen）
• 1.2.3 水杨酸（salicylic acid,SA）
• 2 植物抗病基因
• 2.1 抗病基因的克隆
• 2.2 抗病基因的特性
• 3 植物抗病性的分子机制
• 3.1 与病原体非亲和因子有关的抗病机制
• 3.2 与病原体亲和因子有关的植物抗病性机制
• 4 信号传导
• 4.1 信号传导的作用机理
• 4.2 抗病信号途径
• 4.2.1 水杨酸（salicylic acid,SA）介导的抗病信号途径
• 4.2.2 茉莉酸（jasmonic acid,JA）和乙烯（ethylene,ET）介导的抗病信号转导途径
• 5 展望
• 第二章 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白研究进展
• 1 PGIP的特点
• 2 PGIP的生物学功能及作用机理
• 3 PGIP基因及其表达
• 3.1 多数植物PGIP基因表达蛋白特有的保守序列
• 3.2 PGIP基因多以基因家族的形式存在
• 3.3 PGIP基因表达方式多样性
• 4 PGIP在基因工程中的应用
• 5 展望
• 第三章 葡萄砧木PGIP基因的克隆及生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 基因组DNA的提取和检测
• 1.2.2 PGIP基因引物的设计
• 1.2.3 PGIP基因的PCR反应体系及条件
• 1.2.4 PGIP基因PCR产物的回收、纯化、连接、转化与测序
• 2 结果与分析
• 2.1 ‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP基因的克隆与测序
• 2.2 ‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP基因的序列分析
• 2.2.1 ‘5BB’PGIP基因序列分析
• 2.2.2 ‘1202’PG/P基因序列分析
• 2.2.3 ‘Beta’PG/P基因序列分析
• 2.3 ‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP基因序列的比较
• 2.4 ‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP的疏水性/亲水性和信号肽分析
• 2.4.1 ‘5BB'、‘1202’和‘Beta’PGIP疏水性和亲水性分析
• 2.4.2 ‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP的信号肽分析
• 2.5 ‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP的三级结构分析
• 2.6 ‘5BB’、‘1202’和‘Beta’PGIP基因的聚类分析
• 3 讨论
• 第四章 农杆菌介导葡萄砧木‘5BB’PGIP基因转化烟草
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料和试剂
• 1.1.2 菌种和质粒
• 1.1.3 烟草组织培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 ‘5BB’PGIP基因的PCR扩增
• 1.2.2 含有‘5BB’PGIP目的基因的植物表达载体的构建
• 1.2.3 构建好的植物表达载体转化农杆菌LBA4404
• 1.2.4 烟草叶盘法遗传转化
• 1.2.5 转基因烟草的检测
• 1.2.6 SOD和CAT酶活性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 ‘5BB’PGIP基因的PCR扩增
• 2.2 含有‘5BB’PGIP目的基因的植物表达载体的构建
• 2.3 Km抗性苗的获得
• 2.4 转基因植株的鉴定
• 2.4.1 转基因烟草PCR检测
• 2.4.2 转基因烟草植株RT-PCR检测
• 2.4.3 转基因烟草植株RT-PCR产物的测序
• 2.4.4 转基因对烟草SOD和CAT酶活性的影响
• 3 讨论
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 附录1:本论文中所用缓冲液及溶液的配置
• 附录2:本论文中所用培养基的配置
• 附录3:本论文中所用感受态CCM80的制备
• 附录4:本论文中农杆菌LBA4404感受态的制备及转化
• 附录5:本论文中登录的序列以及构建的载体序列
• 附图
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢