结核分枝杆菌琥珀酰辅酶A合成酶的克隆表达及其性质研究

论文摘要

结核分枝杆菌是人类死亡的头号杀手，严重影响着人类健康。随着广谱耐药性的出现，其威胁将越来越严峻，开发新的结核病治疗靶标迫在眉睫。结核分枝杆菌的新陈代谢必须适应胞内环境才可能在人巨噬细胞中生存，然而人类对于结核分枝杆菌在宿主细胞和组织的生存过程中的代谢相关知识了解甚少，尤其是核心的中间物代谢。柠檬酸循环是新陈代谢的中心环节。它既是绝大多数生物体主要的分解代谢途径，也是准备提供大量自由能的重要代谢系统，在合成代谢中都以该循环的中间产物为生物合成的前体来源。琥珀酰辅酶A合成酶（succinyl-CoA synthetase，SCS）（EC 6．2．1．5）是柠檬酸循环的重要组成成分，催化该循环中唯一发生底物水平磷酸化的步骤，这一反应是可逆的：琥珀酰辅酶A+NDP+P（i）——琥珀酸盐+CoA+NTP（N指代腺苷酸或鸟苷酸）。SCS由α和β两种亚基构成。本实验室的前期研究，利用双向电泳技术对猫爪草提取物作用前后的结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析，发现琥珀酰辅酶A合成酶的编码基因（Rv0951）在猫爪草作用后其表达明显下调。本文在此基础上展开研究，以期这部分工作能有助于结核病治疗靶标的开发。本研究用PCR技术从结核分枝杆菌基因组DNA中扩增了编码琥珀酰辅酶A合成酶α和β亚基的两个基因（SucD和SucC），其大小分别为1000bp和1200bp左右。将PCR产物分别连入载体pET28a（+）和pET32a（+）中，经菌落PCR、质粒PCR、质粒酶切以及序列测定证明成功构建了重组质粒pSCSα-pET28和pSCSβ-pET32。pET28a（+）和pET32a（+）分别带有卡那霉素抗性标记和氨苄青霉素抗性标记，两重组质粒便具有了相应的筛选标记。两重组质粒分别或同时转入感受态细胞BL21（DE3）中，经IPTG诱导后均可见重组蛋白可溶形式的表达。重组菌经摇瓶培养后，离心收集菌体，超声波破碎，取上清进行亲和纯化。纯化后的蛋白用于圆二色谱和酶活分析。用圆二色谱仪分析重组蛋白的二级结构，将其与在线软件（http://www.Predictprotein.org）预测的结核分枝杆菌SCSα和SCSβ的结构进行了比较。SCS的生物学活性结构存在两种不同的形式：哺乳动物线粒体的SCS仅仅以αβ二聚体发挥功能，大肠杆菌中则以（αβ）2四聚体的形式发挥活性。本文以大肠杆菌SCSα和SCSβ的晶体结构作为模板探讨了结核分枝杆菌SCSα和SCSβ的三级结构，发现这两个物种的SCSα和SCSβ结构都非常相似，推测结核分枝杆菌发挥其生物学功能的SCS结构与大肠杆菌的一致。酶活分析表明共转pSCSα-pET28和pSCSβ-pET32的重组菌的纯化蛋白具有SCS的催化活性，即：将琥珀酸盐和CoA转化为琥珀酰辅酶A。由于SCS催化琥珀酸辅酶A与琥珀酸的相互转化是一个可逆过程，极易向正反两个方向进行。本文用HPLC探讨了SCS两个亚基不同的表达水平对宿主产生琥珀酸的影响，所用菌株为：①表达宿主菌BL21（DE3）：②表达pET28a（+）载体蛋白的BL21（DE3）；③表达pET32a（+）载体蛋白的BL21（DE3）；④表达SCSa融合蛋白的BL21（DE3）；⑤表达SCSβ融合蛋白的BL21（DE3）；⑥同时表达SCSα融合蛋白和SCSβ融合蛋白的BL21（DE3）。发现①②③诱导前后琥珀酸的含量都较高（10 g／L～20 g／L）；④⑤⑥诱导前后琥珀酸的含量都较低（0.48 g／L～10 g／L），其中④经诱导后琥珀酸的产量为诱导前的5～17倍，⑤经诱导后琥珀酸的产量为诱导前的0.9～3.9倍，⑥经诱导后琥珀酸的产量为诱导前的0.56～1.09倍。说明SCS的任何一个亚基的过量表达都有助于琥珀酸的积累，而两个亚基都同时过量表达却有利于琥珀酸转化为琥珀酰辅酶A。琥珀酰辅酶A为许多化合物合成的重要中间产物，它还参与厌氧菌特有的烃类降解的代谢过程中的第六步：苯甲酰琥珀酰辅酶A分解成苯甲酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，后者又参与第二步反应把辅酶A转移到苯甲酰琥珀酸上，形成循环。潜伏期结核菌可能启动类似的代谢机制应对低氧或缺氧环境，但目前尚未见相关研究。由此我们推测结核分枝杆菌致病过程存在强大的琥珀酰辅酶A合成酶的调控系统以应对外界环境的变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 结核病与结核分枝杆菌
• 1.2 琥珀酰辅酶A合成酶的研究进展
• 第二章 前言
• 第三章 实验材料和方法
• 3.1 材料和试剂
• 3.2 方法
• 第四章 实验结果与讨论
• 4.1 PCR方法获得SCS编码序列
• 4.2 重组质粒的构建及鉴定
• 4.3 重组质粒序列测定结果
• 4.4 重组蛋白的表达及纯化
• 4.5 重组蛋白的二级结构测定
• 4.6 结核分枝杆菌SCS的三级结构预测
• 4.7 大肠杆菌、结核分枝杆菌、猪和人的琥珀酰辅酶A合成酶的活性位点分析
• 4.8 重组蛋白的活性测定
• 4.9 重组蛋白对宿主菌琥珀酸含量的影响
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢