基于无外源激素的肉苁蓉细胞培养工艺研究及其速溶茶开发

论文摘要

针对肉苁蓉细胞悬浮培养的特点以及食品添加剂安全性的要求,设计了无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞培养模式,研究了其对肉苁蓉悬浮细胞生长和次生代谢产物积累的影响,同时考察了糖代谢和内源激素代谢相关酶的变化。通过前体饲喂和诱导子添加,有效地促进了无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞合成苯乙醇苷(PeGs)的能力。采用响应面分析法优化PeGs超声波提取工艺,并与性温、具有抗氧化活性的红茶复配,开发具有特殊药理活性的苁蓉速溶茶。研究结果如下:设计的无外源激素悬浮培养模式,既不影响肉苁蓉细胞的生长,也不影响主要次生代谢产物的合成。在第21d收获时,细胞干重、苯乙醇苷、总黄酮和多糖的产量分别达18.5g/L、3.64、0.75和4.2g/LDw,均比添加外源激素悬浮培养的肉苁蓉细胞(HC)合成产量高。无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞(HFC)过程中,消耗蔗糖速率较慢,内源激素代谢相关酶IAA氧化酶和细胞分裂素氧化酶活性变化趋势相似。然而肉苁蓉细胞合成PeGs的能力不稳定,代与代之间变化相对较大。苯丙氨酸、酪氨酸和膨润土在无外源激素悬浮培养过程中均能增强PeGs含量的积累。在第12d分别添加时,其最适浓度分别为0.3mmol/L、0.03mmol/L和1.5g/L,细胞中PeGs的产量分别是对照HC的2.02、2.02和2.5倍。在上述浓度基础上,确定了它们的最佳添加时间分别为第8d,12d和16d,PeGs的产量分别是对照HC的1.49、1.41和1.25倍。通过在第16d协同添加苯丙氨酸、酪氨酸和膨润土诱导,PeGs产量达到最高8.21g/LDw,比对照HC提高了24%。利用响应面法对超声提取无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞中PeGs的工艺条件进行优化,得到了最佳工艺条件:乙醇浓度50%,超声功率200W,超声时间14min,液料比90:1,PeGs的一次提取得率达27.63%。采用正交试验获得最优红茶提取工艺为:浸提温度90℃,浸提时间15min,料液比1:20,浸出率达到23.33%。以肉苁蓉悬浮细胞和红茶浸提液为原料,研制出具有保健功能的苁蓉速溶茶,最佳配方为:红茶:肉苁蓉浸提液:30:5,麦芽糊精11.67%,柠檬酸0.15%,蔗糖5%。利用现代生物技术开展无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞,提取生物活性产物PeGs开发速溶茶,是解决市场需求和保护野生资源的有效途径,具有很高的经济价值和生态效益,在中草药细胞培养和食品加工领域具有极其重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第1章 文献综述
• 1.1 植物细胞培养研究概况
• 1.1.1 植物细胞培养技术研究进展
• 1.1.2 植物细胞培养生产次生代谢产物
• 1.1.3 激素对植物细胞培养的影响
• 1.2 肉苁蓉资源及有效成分
• 1.2.1 肉苁蓉的种类与资源
• 1.2.2 肉苁蓉的有效成分及药用价值
• 1.3 肉苁蓉细胞培养与PeGs 的合成
• 1.3.1 愈伤组织的诱导
• 1.3.2 培养条件的优化
• 1.3.3 通过前体饲喂提高PeGs 的合成
• 1.3.4 添加诱导子提高PeGs 的含量
• 1.3.5 PeGs 可能的生物合成途径
• 1.4 肉苁蓉有效成分的提取
• 1.5 肉苁蓉产品的开发与利用
• 1.6 速溶茶的研究进展
• 1.7 研究内容与技术路线
• 1.7.1 研究内容
• 1.7.2 技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞株系及其培养
• 2.1.2 细胞株系的活化
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 实验试剂
• 2.2 分析方法
• 2.2.1 细胞生物量的测定
• 2.2.2 肉苁蓉苯乙醇苷（PeGs）的测定
• 2.2.3 肉苁蓉总黄酮的测定
• 2.2.4 肉苁蓉多糖的测定
• 2.2.5 酚类积累的测定
• 2.2.6 碳源代谢的监测
• 2.2.7 细胞活力的测定
• 2.2.8 PAL 酶活测定
• 2.2.9 POD 酶活测定
• 2.2.10 IAA 氧化酶活力的测定
• 2.2.11 细胞分裂素氧化酶活力的测定
• 2.2.12 前体和膨润土诱导子的制备
• 2.2.13 茶多酚含量的测定
• 2.2.14 感官指标检测
• 2.2.15 理化指标检测
• 2.2.16 微生物指标检测
• 第3章 无外源激素培养模式下的肉苁蓉细胞生长与代谢
• 3.1 无外源激素培养对肉苁蓉悬浮细胞生长的影响
• 3.2 无外源激素培养对肉苁蓉悬浮细胞合成次生代谢产物的影响
• 3.2.1 无外源激素培养对肉苁蓉悬浮细胞合成PeGs 的研究
• 3.2.2 无外源激素对肉苁蓉悬浮细胞合成总黄酮和肉苁蓉多糖的研究
• 3.2.3 无外源激素对肉苁蓉悬浮细胞多酚积累的研究
• 3.3 无外源激素培养肉苁蓉愈伤组织合成PeGs 稳定性的研究
• 3.4 无外源激素培养肉苁蓉悬浮细胞糖代谢规律的研究
• 3.5 无外源激素培养过程中激素代谢相关酶活力变化
• 3.5.1 无外源激素培养过程中POD 活性研究
• 3.5.2 无外源激素培养过程中IAA 氧化酶活性研究
• 3.5.3 无外源激素培养过程中细胞分裂素氧化酶活性研究
• 3.6 小结
• 第4章 无外源激素培养模式下氨基酸对肉苁蓉悬浮细胞生长和PeGs 合成的影响
• 4.1 氨基酸添加对细胞生长和PeGs 合成的影响
• 4.1.1 色氨酸添加对细胞生长和PeGs 合成的影响
• 4.1.2 精氨酸添加对细胞生长和PeGs 合成的影响
• 4.1.3 苯丙氨酸添加对细胞生长和PeGs 合成的影响
• 4.1.4 酪氨酸添加对细胞生长和PeGs 合成的影响
• 4.2 前体物添加时间对细胞生长和PeGs 合成的影响
• 4.3 前体物饲喂过程中细胞生长和PeGs 合成的变化
• 4.3.1 苯丙氨酸饲喂过程中细胞生长和PeGs 合成的变化
• 4.3.2 酪氨酸饲喂过程中细胞生长和PeGs 合成的变化
• 4.4 小结
• 第5章 无外源激素培养模式下膨润土对肉苁蓉悬浮细胞生长和PeGs 合成的影响
• 5.1 膨润土添加对细胞生长和PeGs 合成的影响
• 5.2 膨润土添加时间对细胞生长和PeGs 合成的影响
• 5.3 膨润土诱导过程中细胞生长和PeGs 合成的变化
• 2 模拟膨润土诱导过程中细胞生长和PeGs 合成的变化'>5.4 CaCl₂ 模拟膨润土诱导过程中细胞生长和PeGs 合成的变化
• 5.5 前体和膨润土的协同作用对肉苁蓉悬浮细胞生长和PeGs 合成的影响
• 5.5.1 协同方案1 对肉苁蓉悬浮细胞生长和合成PeGs 的影响
• 5.5.2 协同方案2 对肉苁蓉悬浮细胞生长和PeGs 合成的影响
• 5.5.3 协同方案3 对肉苁蓉悬浮细胞生长和PeGs 合成的影响
• 5.6 小结
• 第6章 响应面法优化悬浮培养肉苁蓉细胞中 PeGs 超声提取工艺及其速溶茶的研制
• 6.1 响应面分析法优化PeGs 超声波提取工艺的研究
• 6.1.1 乙醇浓度对超声提取PeGs 的影响
• 6.1.2 超声时间对PeGs 提取的影响
• 6.1.3 超声功率对PeGs 提取的影响
• 6.1.4 液料比对超声提取PeGs 的影响
• 6.1.5 响应面法对PeGs 提取工艺条件的优化
• 6.2 肉苁蓉细胞速溶茶饮料的开发
• 6.2.1 肉苁蓉细胞速溶茶工艺的研究
• 6.2.2 产品质量标准
• 6.2.3 成本估算
• 6.3 小结
• 第7章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 附录 图片
• 作者简介
• 致谢
• 导师评阅表