论文摘要
多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种浆细胞的恶性疾病,以大量单克隆免疫球蛋白的分泌、贫血、骨骼破坏及肾功能损害为主要临床表现。近年来,新的化疗药物的出现如蛋白体酶抑制剂、反应停以及在外周血造血干细胞（PBSC）支持下的大剂量化疗等虽取得了一定疗效,病人中位生存期已从7个月延长至5年,但最终都不可避免产生耐药,MM仍是一种难以治愈的恶性血液病,迫切需要寻找新的治疗药物。近年来,我国学者积极探索肿瘤的中药治疗方法,已发现数十种具有抗肿瘤作用的中药成分。青蒿素（artemisinin,ARS）及其衍生物是一类高效、低毒的抗疟药物,尤其对耐氯喹和其它抗疟药物耐药的间日疟和恶性疟有良效,在临床上得到广泛的应用。随着研究的深入,人们发现青蒿素类化合物还具有其它很多重要的药理活性,如抗血吸虫、免疫调节、抗心律失常、抗肿瘤等,尤其是其抗肿瘤作用,越来越引起研究者们的重视。美国癌症协会研究表明,在55种人体肿瘤细胞株中对青蒿琥酯最敏感的为白血病及结肠癌细胞,其IC50分别为1和2μM;非小细胞肺癌敏感性最差,IC50为26μM,中度敏感的有黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌,前列腺癌、中枢神经系统肿瘤及肾癌细胞等,其IC50介于二者之间,其它研究也显示,青蒿素类化合物对多种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用。青蒿素类化合物另一显著特点是与传统化疗药物不存在交叉耐药,不但对耐药的疟原虫有效,而且对耐药的肿瘤细胞有效;且具有毒副作用轻、患者容易耐受等优点,这为研究开发经济、有效的抗骨髓瘤药物提供了新的线索。本研究以小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为研究对象,并通过建立耐药细胞株及SP2/0实体瘤模型,对青蒿素衍生物青蒿琥酯（Artesunate,ART）的抗骨髓瘤的作用及其机制进行了探讨,研究分以下三部分:第一部分青蒿琥酯对SP2/0小鼠骨髓瘤细胞的增殖抑制及凋亡促进作用研究目的观察不同浓度的青蒿琥酯对骨髓瘤细胞SP2/0的增殖抑制及促凋亡作用并对其作用机制进行初步探讨。方法利用MTT法检测不同浓度的青蒿琥酯对SP2/0细胞的增殖抑制作用;常规Giemsa染色、DAPI荧光染色以及透射电镜观察细胞凋亡的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA梯带;利用AnnexinⅤ/PI双染及流式细胞术检测青蒿琥酯干预24、48、72小时细胞的凋亡率及细胞周期的变化;Western blotting检测胞核中核因子kappaB（NF-κB p65）、胞浆中NF-κB抑制因子（IκBα）的蛋白水平,ArraystarTM转录因子试剂盒检测NF-κB p65的转录活性。结果1 ART能抑制SP2/0细胞增殖,呈现剂量、时间依赖性:ART作用24时后,2μg/ml组对细胞的增殖已产生了抑制作用,抑制率达32.97%。随着浓度增加,ART抑制细胞增殖作用增强,40μg/ml组抑制率达43.25%,呈剂量依赖性（P=0.0023）。随作用时间延长,ART各浓度组增殖抑制作用逐渐增强。72时后,2μg/ml组抑制率即达53.2%,40μg/ml组抑制率达91.86%,显示ART对SP2/0细胞的强效增殖抑制作用,呈现出时间依赖性（P=0.0000）。但在相同浓度下,其抑制SP2/0细胞增殖的作用强度弱于阿霉素。2 ART作用后SP2/0细胞出现了凋亡的形态学改变:药物作用前细胞胞体饱满、胞质丰富、胞核完整均匀,DAPI染色细胞无荧光标记,透射电镜下染色质细致均匀,核仁清晰,细胞器完整,细胞微绒毛清晰可见。无凋亡的形态学改变。药物作用后细胞明显缩小,染色质凝聚、边缘化,有的呈空泡及新月状改变,胞核固缩、碎裂、出现凋亡小体等细胞凋亡的形态学改变。透射电镜还可观察到细胞微绒毛消失,细胞器结构不完整。3 10μg/ml ART作用24小时后,DNA琼脂糖凝胶电泳出现大小为180至200bp及其倍数的梯状条带,片断之间呈一定间隔,这是DNA在核小体间成倍断裂的结果,对照组细胞未出现DNA降解现象。4 ART在2μg/ml～40μg/ml浓度范围内诱导SP2/0细胞凋亡呈现出明显时间、剂量依赖性:ART作用24小时后,2μg/ml组的细胞凋亡率已有明显增加,（与0μg/ml组比较P<0.05）,凋亡率波动于10%～20%之间。ART作用48小时后,凋亡率波动于50%～80%之间。40μg/ml组作用48小时后,SP2/0细胞凋亡率达78.7%（与0μg/ml组比较P<0.05）。5药物处理24、48小时后收集各组细胞,用流式细胞仪检测细胞周期分布,各浓度组与0μg/ml组比较,G0/G1期细胞数目增多,G2/M+S期细胞显著减少（P<0.05）。6 Western blotting显示,随着ART作用时间的延长,NF-κB p65蛋白的表达水平呈下降趋势,以作用48小时后的各组下降显著。未经ART处理组及10μg/ml ART作用24、48、72、96h的灰度值分别为5294.23±240.25、2609.13±126.32、558.58±111.25、552.83±98.56、545.9±79.62。IκBα蛋白的表达增加,提示其降解减少,未经ART处理组及10μg/mlART作用24、48、72、96h的灰度值分别为6986.47±356.96、7207.58±256.24、7936.46±126.37、8212.23±246.31、9227.30±330.12。7 10μg/ml ART作用24、48、72、96h后,NF-κB p65转录活性逐渐下降,活性抑制率分别为66.3%、68.4%、76.0%、89.6%,呈现出时间依赖性（P<0.01）,以青蒿琥酯作用96小时,SP2/0细胞活性下降最明显。结论青蒿琥酯对SP2/0骨髓瘤细胞有显著的增殖抑制和凋亡诱导作用,其作用机制与抑制NFκB转录活性有关。体外研究显示,青蒿琥酯是一种潜在的抗骨髓瘤药物。第二部分小鼠骨髓瘤多药耐药细胞系SP2/0/ADM的建立和青蒿琥酯逆转耐药作用机制研究目的通过建立多药耐药细胞系,研究青蒿琥酯逆转耐药作用及其机制。方法通过小剂量阿霉素逐渐加量诱导方法建立多药耐药小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0/ADM;光镜下观察SP2/0/ADM细胞的形态学改变;通过细胞计数计算其倍增时间;流式细胞术观察细胞周期分布;罗丹明123排出实验,对P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达状况进行了分析;通过MTT实验对其交叉耐药谱进行了分析;观察ART对SP2/0/ADM细胞的增殖抑制作用,计算其IC20值;MTT实验就ART（IC20）对SP2/0/ADM细胞的耐药逆转作用进行观察;通过实时定量PCR对ART作用24、48、72、96h的SP2/0/ADM细胞MDR mRNA的表达水平进行分析;Western blotting对10μg/ml ART作用24、48、72、96h的SP2/0/ADM细胞P-gp蛋白表达水平进行分析。结果1 ADM诱导过程中,细胞生长缓慢,大部分细胞形态无明显改变,偶见少量不规则细胞,胞浆颗粒增多。建立稳定耐药细胞系后,SP2/0/ADM细胞逐渐恢复正常生长状态,光镜下SP2/0/ADM细胞与SP2/0细胞相似,呈单层排列生长,细胞圆形、边界清楚,大小均一,核圆形,细胞大小无明显改变,胞浆颗粒恢复正常。其倍增时间为35.28±7.56h,与亲本细胞（33.84±5.68h）比较无明显改变（P>0.05）。SP2/0/ADM细胞与亲本细胞相比G0/G1无明显改变（P>0.05）,S期细胞减少（P<0.05）G2/M期细胞增多（P<0.05）。2 MTT实验结果显示SP2/0/ADM细胞不但对阿霉素（Adriamycin,ADM）产生了耐药性,耐药指数为22.7,而且对米托蒽醌、足叶已甙、甲氨蝶呤也有不同程度的交叉耐药,其耐药指数分别为4.2、2.9和5.3。3通过罗丹明123排出实验对P-gp活性进行比较,SP2/0/ADM细胞由于P-gp蛋白表达增加,进入细胞中的罗丹明被大量排出,荧光强度低。SP2/0细胞中P-gp低表达,大量罗丹明累积,故荧光强度大。4 ART能抑制SP2/0/ADM细胞增殖,随着药物浓度增加,其增殖抑制作用增强,呈剂量依赖性（P<0.05）。计算其IC20为0.29μg/ml,我们选取0.3μg/ml行耐药逆转实验,发现青蒿琥酯可增强阿霉素对SP2/0/ADM细胞的毒性作用,其IC50值由17.80μg/ml降至4.27μg/ml,耐药逆转倍数为4.16倍（P<0.05）。5青蒿琥酯作用24、48、72、96h后SP2/0/ADM细胞MDR1 mRNA的表达下降,2-△△Ct分别为0.0887±0.0023、0.0556±0.0036、0.0338±0.0031、0.0186±0.0014,各组之间的差异具有显著性（P<0.05）,呈时间依赖性。6 Western blotting显示,随着ART作用时间的延长,SP2/0/ADM细胞P-gp蛋白表达水平呈下降趋势。未加ART组及ART作用24、48、72、96h各组,其灰度值分别为6568.23±156.95、4459.13±297.12、4218.31±153.25、3558.58±241.32、3024.83±157.35（P<0.05）。结论SP2/0/ADM细胞为稳定的多药耐药细胞株;青蒿琥酯能逆转SP2/0/ADM细胞的多药耐药,通过抑制MDR1/P-gp基因表达是其作用机制之一。第三部分青蒿琥酯抑制血管新生的实验研究目的对青蒿琥酯抑制血管新生的作用进行观察并探讨其机制方法通过三维血管模型观察青蒿琥酯对人血管内皮细胞迁移活性的影响:利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,观察青蒿琥酯对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响;通过建立SP2/0小鼠实体瘤模型,观察青蒿琥酯对移植瘤抑制效应;CD34免疫组化观察青蒿琥酯对SP2/0小鼠移植瘤血管密度的影响;实时定量PCR检测瘤组织中VEGF mRNA的表达水平;Western blotting检测瘤组织中VEGF蛋白的表达水平。结果1 ART作用5d后,毛细血管样“出芽”的形成明显受到抑制,0、10、20、40μg/ml各组平均出芽长度分别为10.3±1.03、8.2±1.5、5.3±1.8、2.68±0.95μm,存在剂量依赖性（P<0.05）。2 ART明显抑制鸡胚尿囊膜血管生成。对照组明胶海绵周围血管生长良好,呈树枝状,分支适中;20μg/ml青蒿琥酯干预组明胶海绵接种部位出现比较明显的无血管区,血管形成明显少于对照组。3 ART能抑制SP2/0小鼠移植瘤的生长,ART在50mg/ kg. d-1、100m g/kg.d-1、200mg/kg.d-1均具有明显的抑制SP2/0瘤体生长作用（P<0.05）,其抑瘤率分别为17.83%、36.54%和47.95%,其中以大剂量组抑瘤效果最佳,但总体效果不如10mg/kg.d-1CTX组明显。4 CD34免疫组化显示,ART能明显抑制肿瘤组织微血管的生成,且呈现剂量依赖性（P<0.05）。对照组、50mg/kg.d-1、100mg/kg.d-1、200mg/kg.d-1ART组及CTX组光密度值分别0.811±0.059、0.602±0.049、0.531±0.087、0.529±0.026、0.201±0.018。5 ART能抑制VGEF mRNA的表达,呈剂量-效应关系,随其浓度增加,VGEF mRNA的表达减少,各组之间的差异具有显著性（P<0.05）。ART（50m g/kg.d-1、100mg/kg.d-1、200mg/kg.d-1）和10mg/kg.d-1CTX组2-△△Ct值分别为0.1086±0.0012、0.0838±0.0021、0.0456±0.0054、0.0288±0.0043。6 ART能抑制移植肿瘤组织VGEF蛋白的表达,生理盐水对照组、ART（50mg/kg.d-1、100mg/kg.d-1、200mg/kg.d-1）和10mg/kg.d-1CTX组灰度值分别为8924.47±250.35、8126.35±345.32、4527.13±112.96、4051.72±168.24、2773.77±302.56,其中ART组对VGEF蛋白表达的抑制呈剂量-效应关系（P<0.05）。结论体内研究显示ART能抑制SP2/0实体瘤生长,其机制与抑制VEGF基因表达,进而抑制血管新生有关;青蒿琥酯可能是有效的抗骨髓瘤药物。总结体外及体内研究显示,ART为一种有效的抗骨髓瘤药物,其机制与抑制骨髓瘤细胞增殖、诱导凋亡、逆转耐药及抑制血管新生有关,将其开发成为新型有效的抗骨髓瘤药物运用于临床,具有广泛的应用前景。
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