抗2型登革病毒M蛋白和NS1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

论文摘要

目的:近年来,登革病毒（DV）在世界许多国家和地区,尤其是东南亚流行趋势加重,已成为全球严重的公共卫生问题。由于目前尚无有效预防登革病毒感染的疫苗上市,而登革出血热和登革热休克综合征的死亡率较高,因此早期快速准确的诊断登革病毒感染就显得尤为重要。目前新问市的登革病毒感染诊断试剂主要是以全病毒或重组E蛋白为检测抗原,其特异性和灵敏性有待进一步深入研究。本研究拟利用2型登革病毒New Guinea C株（NGC株）重组质粒克隆表达重组M蛋白和NS1蛋白,制备抗2型登革病毒M蛋白和NS1蛋白的单克隆抗体,并对其生物学特性进行了鉴定,为下一步制备快速检测登革病毒感染的胶体金试纸条奠定基础。方法:诱导表达含DV2 prm、ns1基因的原核表达重组载体pET-32a（+）/prM、pET-32a（+）/M、pQE-30/NS1,并且采用了Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,以SDS-PAGE进行初步鉴定,并以兔抗登革病毒免疫血清鉴定其免疫活性。以重组蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗登革病毒重组蛋白的McAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行McAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定McAb的Ig亚类、效价及亲和力进行分析。结果:重组蛋白pET-32a（+）/M、pQE-30/NS1以上清和包涵体表达,用兔抗登革病毒血清检测发现上清中蛋白抗原活性强。利用Ni2+-NTA树脂亲和层析方法,从上清中纯化蛋白获得成功。通过杂交瘤技术成功获得3株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6,Ⅲ3D2和Ⅲ4C3。其中Ⅲ1A6,Ⅲ4C3的抗体亚类均为IgG1;Ⅲ3D2的抗体亚类为IgG2a。细胞培养上清的效价分别为1:106 , 1:105和1:106;3株单抗的亲和常数均在107以上。Western bolt检测证明3株杂交瘤细胞所分泌的McAb特异性良好。结论:成功地制备出抗M蛋白的2株McAb和抗NS1蛋白的1株McAb,为进一步建立快速特异检测登革病毒感染的实验方法提供了有力的工具。

论文目录

• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 2 型登革病毒 PRM、NS1 基因的扩增，重组质粒构建
• 前言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 PRM，NS1 编码基因PCR 扩增
• 3.2 重组质粒的鉴定
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二部分 2 型登革病毒PRM，NS1 基因在大肠杆菌中的高效表达、纯化
• 前言
• 1 材料
• 1.1 质粒、菌株和血清
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液配制
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三部分 抗M 蛋白和NS1 蛋白单克隆抗体的制备
• 前言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第四部分 抗M 蛋白和NS1 蛋白单克隆抗体的鉴定
• 前言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文目录