五指山小型猪基因组BAC文库的构建与北京油鸡风味特性基因的研究

论文摘要

抽取一只雄性五指山小型猪静脉血,用于制备大分子量基因组DNA,制备好的基因组DNA经HindⅢ部分酶切后,二次脉冲电泳分离所需DNA片段。电洗脱回收100～400kb范围的片段,然后与pBeoBAC11载体连接,转化DH10B感受态细胞,经过培养,挑取和保存白色单克隆。基因组文库的质量一般从文库的平均插入、基因组覆盖率、嵌合率二方面来衡量。本研究所构建中国特有五指山小型猪基因组BAC文库,含有153,600个BAC克隆（保存在40个超级池,每个超级池由10个384孔板组成）。随机挑选了270个BAC克隆的插入片段进行估计,平均为152.3kb,其中空克隆的比例为1.3%,表明文库的覆盖率7.4倍,预计从文库中筛选到单拷贝基因的机率为99.93%。文库中78%的克隆插入大于100 kb,而且有部分克隆甚至大于300kb,这样大小的插入可以满足所有试验对于片段大小的要求。从各个方面来看,本文构建的文库都适用于功能基因和物理图谱构建的研究。构建北京油鸡成纤维靶细胞系,细胞冻存个体数达45个,冻存细胞支数达170支,每支细胞含量为3～5×106细胞/ml,保证北京油鸡遗传基因的群体多样性,同时为外源基因在细胞中的表达提供了良好的体外培养靶细胞。使北京油鸡这一国家重要遗传资源在细胞水平上得以保存下来,并为相关遗传学研究提供了有效的理论依据和理想的生物材料。通过细胞形态学观察、细菌、真菌、支原体检测、生长曲线、核型分析及同工酶检测等多项细胞系质量检测,结果表明建立的北京油鸡成纤维细胞系性质稳定,生物学性能正常,各项指标均达到美国典型培养物保藏中心细胞系鉴定标准。利用6种荧光蛋白基因在所建细胞系中得到良好的表达,说明细胞具有良好的被转染能力,从基因表达的水平上进一步确定细胞系的遗传性能良好,为进行北京油鸡风味特色功能基因的表达、定位和克隆化细胞的筛选鉴定了基础。采用RT-PCR与RACE方法扩增出北京油鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）基因全长cDNA序列,该基因开放阅读框长为1455个碱基,编码485个氨基酸;构建成北京油鸡ADSL基因融合表达载体pGEX-ADSL,转化大肠杆菌BL2（1DE3）,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白在分子量约为80.5kD处有特异的蛋白条带,与预期分子量大小一致,等电点为6.79。该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,5h达最高值,达到细胞总蛋白的26.9%,且主要以不可溶的包涵体形式存在,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为北京油鸡ADSL蛋白,为其进一步的具有生物学功能研究及其应用鉴定了基础。提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA,利用RT-PCR方法扩增检测purH基因mRNA的差异表达水平。构建带有荧光蛋白报告基因的真核重组表达载体pEGFP-N3-purH,pEYFP-N1-purH和pDsRed1-N1-purH。并利用G418药物筛选和对荧光强度高的单克隆化培养。实验结果:在转染后24、48和72h,重组融合蛋白转染率在10.3%～53.2%之间。pEGFP-N3-purH,pEYFP-N1-purH与pDsRed-N1-purH在北京油鸡成纤维细胞的细胞核与细胞质均有分布,呈弥散分布。经药物筛选和单克隆化培养,获得表达pEGFP-N3-purH,pEYFP-N1-purH与pDsRed-N1-purH融合蛋白的阳性克隆细胞株,经RT-PCR扩增与Western blot检测确认了purH融合蛋白基因已经整合到北京油鸡成纤维细胞的基因组中,获得正常表达。本研究构建了高质量的五指山小型猪基因组BAC文库,从全基因组水平上保存了五指山猪的遗传资源,为功能基因组学研究和后基因组学研究提供了重要的试验材料和实物基础。创建的北京油鸡成纤维靶细胞系从细胞水平保存了北京油鸡的基因资源,同时为风味特色基因的表达提供重要的靶细胞。由于供体细胞的质量对于转基因动物克隆非常重要,本研究利用抗性筛选和克隆化培养获得北京油鸡ADSL基因1株与purH基因3株的阳性细胞株,一方面为北京油鸡转基因动物克隆提供了重要的试验材料,为进一步培育出风味优良、肉质鲜美的转基因鸡提供优质供体细胞;另一方面对于鉴定ADSL与purH基因是否是控制北京油鸡风味特性优良的主效基因,以期对于提高我国地方鸡种种质资源创新,实现育种理论和关键技术新突破等具有一定指导作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1. 国内外畜禽遗传资源现状
• 1.1 世界畜禽遗传资源现状
• 1.2 我国畜禽遗传资源现状
• 2. 细菌人工染色体（BAC）的发展及应用
• 2.1 细菌人工染色体（BAC）的发展概述
• 2.2 BAC 基因组文库的应用
• 2.3 BAC转基因技术研究进展与应用
• 2.4 已构建的基因组BAC文库
• 3. 转基因技术概况
• 3.1 转基因方法概述
• 3.2 利用转基因技术对我国地方鸡种优良性状的改良
• 4 畜禽遗传资源细胞库的建立及质量检测
• 4.1 畜禽体细胞库的构建
• 4.2 我国畜禽体细胞库的建立的优势
• 4.3 细胞系质量检测标准
• 5. 我国特有地方畜禽品种五指山微型猪、北京油鸡优良、抗逆和抗病基因研究现状及预期分析
• 5.1 五指山小型猪研究现状
• 5.2 北京油鸡风味特性基因研究现状
• 5.3 腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）基因的研究进展
• 5.4 氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶/次黄嘌呤核苷酸环水解酶（purH）基因的研究进展
• 第二章 五指山小型猪基因组BAC 文库的构建
• 1 材料
• 1.1 主要药品和酶
• 1.2 主要仪器
• 1.3 常规试剂
• 2 五指山小型猪基因组 BAC 文库的构建
• 2.1 样品，菌株与质粒
• 2.2 试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 BAC 载体的制备
• 2.3.2 碱裂解法大量提取 BAC 质粒
• 2.3.3 CsCL-EtBr 密度梯度离心纯化得到的超螺旋质粒
• 2.3.4 BAC 载体的后期处理（酶切和去磷酸化）
• 2.3.5 电转化感受态细胞DH lOB的制备
• 2.3.6 琼脂糖包埋法制备基因组大片段
• 2.3.7 预电泳、大片段基因组DNA 的部分酶切
• 2.3.8 脉冲场电泳分离最适高分子量DNA 片段
• 2.3.9 电洗脱回收基因组
• 2.3.10 基因组DNA 和载体DNA 的连接与转化
• 3 BAC 文库的保存与鉴定
• 3.1 单克隆分离和培养
• 3.2 使用机械手分装菌液
• 3.3 文库的鉴定
• 4 实验结果
• 4.1 BAC 载体的提取和纯化
• 4.2 载体的酶切和去磷酸化
• 4.3 高分子量基因组（HMW genome）DNA 的制备
• 4.4 基因组DNA的部分酶切
• 4.5 大片段DNA 的二次分离与电洗脱法回收酶切片段
• 4.6 连接与条件条件的确定
• 5 讨论
• 5.1 BAC载体制备技术
• 5.2 高分子量DNA 的制备技术
• 5.3 大片段DNA 的回收技术
• 5.4 载体与高分子量DNA连接技术
• 5.5 电激转化技术
• 5.6 BAC文库的鉴定
• 6 小结
• 第三章 北京油鸡转基因靶细胞系的创建
• 1 材料和方法
• 1.1 主要材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 原代培养、传代、冻存和复苏
• 1.2.2 细胞活力测定
• 1.2.3 生长曲线
• 1.2.4 细胞系的微生物检测
• 1.2.5 染色体分析
• 1.2.6 细胞系的同工酶酶谱分析
• 1.2.7 脂质体介导的六种荧光蛋白基因在北京油鸡鸡胚成纤维细胞中的表达
• 2 结果与分析
• 2.1 北京油鸡成纤维靶细胞形态学观察
• 2.2 细胞生长的动态观察
• 2.3 微生物污染检测结果
• 2.4 染色体分析
• 2.5 细胞系的同工酶酶谱分析
• 2.6 脂质体介导的六种荧光蛋白基因转染北京油鸡胚成纤维细胞的检测结果
• 3 讨论
• 3.1 北京油鸡转基因靶细胞系的创建
• 3.2 核型分析
• 3.3 细胞系种间污染
• 3.4 外源基因在细胞中的表达
• 4 小结
• 第四章 北京油鸡 ADSL 基因的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 北京油鸡
• 1.1.2 质粒与菌株
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 总 RNA 的抽提
• 1.2.2 北京油鸡ADSL 基因cDNA 全序列的扩增与3′、5′RACE
• 1.2.3 引物设计与北京油鸡 ADSL 基因成熟肽片段的获得
• 1.2.4 ADSL 基因5′侧翼调控区的研究
• 1.2.5 北京油鸡ADSL 基因在体内的表达研究
• 1.2.6 北京油鸡ADSL基因表达载体的构建
• 1.2.7 重组北京油鸡ADSL的表达及SDS-PAGE分析
• 1.2.8 重组北京油鸡GST-ADSL 融合蛋白的纯化
• 1.2.9 Western-blotting 检测融合蛋白
• 1.2.10 北京油鸡ADSL基因真核表达载体构建与脂质体介导转染成纤维细胞.
• 1.2.11 生物信息学分析
• 2 结果
• 2.1 北京油鸡ADSL 全长cDNA 的克隆及序列测定
• 2.2 5′侧翼调控区分析
• 2.3 不同物种间 ADSL氨基酸序列比对分析
• 2.4 北京油鸡ADSL基因组序列分析
• 2.5 北京油鸡ADSL 基因体内表达情况
• 2.6 融合表达载体pGEX-ADSL 的构建
• 2.7 重组北京油鸡ADSL 的表达及SDS-PAGE
• 2.8 北京油鸡pGEX-ADSL 融合蛋白的可溶性检测及纯化
• 2.9 Western blot检测重组融合蛋白
• 2.10 ADSL 在转染细胞中的亚细胞定位
• 2.11 北京油鸡ADSL 的三级结构分析
• 3. 讨论
• 3.1 全长ADSL 基因cDNA 序列及其编码氨基酸序列分析
• 3.2 ADSL 基因5′侧翼调控区的研究
• 3.3 ADSL 基因功能分析
• 3.4 ADSL 组织特异性表达
• 3.5 pGEX-ADSL 融合蛋白的表达与活性鉴定
• 3.6 pEGFP-N3-ADSL在细胞中的定位
• 4. 小结
• 第五章 北京油鸡purH 基因的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 北京油鸡
• 1.1.2 质粒与菌株
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 总 RNA 的抽提
• 1.2.2 北京油鸡purH 基因cDNA 全序列的扩增与3′、5′RACE
• 1.2.3 北京油鸡PURH 基因在体内的表达研究
• 1.2.4 北京油鸡purH真核表达载体的构建
• 1.2.5 脂质体介导法转染成纤维细胞及purH 基因的亚细胞分布
• 1.2.6 G418北京油鸡成纤维细胞最小致死量测定与抗性细胞的筛选
• 1.2.7 单克隆阳性细胞株荧光蛋白基因整合、表达的检测及鉴定
• 1.2.8 purH在北京油鸡成纤维细胞中表达检测
• 2. 结果
• 2.1 北京油鸡purH 基因序列分析
• 2.2 北京油鸡purH 基因体内表达情况
• 2.3 北京油鸡purH 基因组分析
• 2.4 purH 真核表达载体的构建
• 2.5 重组外源基因转染率的比较
• 2.6 北京油鸡purH基因的亚细胞定位
• 2.7 克隆化细胞株的筛选
• 2.8 细胞凋亡的检测
• 2.9 阳性细胞株的鉴定
• 2.10 Western blot检测在北京油鸡成纤维细胞中表达的重组融合蛋白
• 3 讨论
• 3.1 全长purH 基因cDNA 序列及其编码氨基酸序列分析
• 3.2 影响转染表达的各种因素
• 3.3 purH 在细胞中的定位
• 3.4 北京油鸡成纤维细胞purH 阳性细胞株的建立
• 3.5 北京油鸡成纤维细胞中表达的重组融合蛋白检测
• 3.6 克隆化细胞的筛选与转基因动物克隆的应用
• 4 小结
• 总结
• 参考文献
• 附录：主要成果与发表相关论文
• 致谢
• 附录