论文摘要
目的转录因子Mathl诱导了终末支持细胞向新生毛细胞的转分化.1)本实验在描述支持细胞转分化为新生毛细胞的形态学变化过程的同时,通过使用正常毛细胞相关特异性标记物,在形态学方面对新生毛细胞和正常毛细胞进行了比较；2)本实验进一步阐述了在Mathl的作用下支持细胞转分化为毛细胞的转分化机制；3)本实验在功能学方面对新生毛细胞与发育中的正常毛细胞进行了比较,探讨其是否已经具备了正常毛细胞的功能性。方法本实验使用了正常出生后3天的新生SD大鼠耳蜗进行体外器官培养,实验组在培养的过程中通过腺病毒转染了Math1（作用基因）和EGFP（报告基因）两个基因（Ad5-EGFP-Mathl）,对照组则只转染了EGFP（Ad5-EGFP）.首先,在转染基因后不同的时间点对培养组织进行固定,通过免疫荧光染色技术标记毛细胞相关特异性蛋白来鉴定是否有新生毛细胞的产生,并描述了转分化的过程；其次,在耳蜗器官培养过程中,通过采用了Brdu掺入法,探讨了支持细胞向新生毛细胞的转分化机制；然后,通过检测新生毛细胞是否有摄取耳毒性药物新霉素, FM1-43的能力,来验证是否存在毛细胞特征性的机械性门控通道；最后,我们采用Patch Clamp技术,在不同的时间点对新生毛细胞的各种通道电流,动作电位以及特征性的机械门控通道电流等在不同时间变化以及相关的动力学分析,验证Math1诱导的新生毛细胞是否已经具备了正常毛细胞的功能。结果①实验组在Ad5-EGFP-Mathl转染耳蜗组织后的第三天,开始在小上皮嵴区域出现了MyosinVIIA阳性细胞,大上皮嵴区域则在转染五天后出现MyosinVIIA阳性细胞；钙缓冲蛋白,如Calbindin,Calmodulin,Calretinin和PMCA2作为毛细胞的相关特异性标记物,也能在异位新生毛细胞上表达；Phlloidin的染色展示了新生毛细胞顶部的簇状静纤毛样结构；在对照组的耳蜗的大、小上皮嵴区域则未出现这些现象；②Brdu掺入实验表明,支持细胞向新生毛细胞的转分化过程为直接转分化,不依赖于支持细胞的增殖；另外,Math1的表达水平是诱导毛细胞分化的关键因素；③1mM的耳毒性药物新霉素能够引起异位新生毛细胞的死亡；从Math1转染后5天,部分新生毛细胞开始有能力对FM1-43的摄取,间接说明毛细胞能通过机械门控通道摄取耳毒性药物及FM1-43；④Mathl转染后的2天,新生毛细胞开始表达钠电流,到第5天电流密度达最大,然后逐渐减小；对照组的支持细胞不表达钠电流；⑤Mathl转染后三天,新生毛细胞开始表达钙电流,电流密度随着时间逐渐增大；对照组支持细胞不表达钙电流；⑥Mathl转染后五天,新生毛细胞表达为快速失活的延迟性钾整流,然后,表现为持续性基本不失活的延迟性钾整流,且电流密度逐渐增大；而对照组的支持细胞仅表达持续不失活的幅度很小的延迟性钾整流；⑦Mathl转染后五天,新生毛细胞表达了典型的HCN电流,且随着时间电流密度逐渐减小,然后消失；⑧大多数的新生毛细胞上能记录到诱发的动作电位,极少数的能记录到自发的动作电位：⑨Mathl转染后7天,我们记录到了新生毛细胞的机械门控通道电流。结论①利用了腺病毒转基因方式成功的建立了新生大鼠耳蜗体外培养在Mathl诱导下产生异位新生毛细胞的模型；②新生毛细胞已经具备正常毛细胞样的形态,并且表达许多相同的特异性相关蛋白；③支持细胞转分化为毛细胞的机制为直接转分化,无需增殖后再转分化；④新生毛细胞有能力摄取耳毒性药物新霉素,FMl-43,间接表明机械门控通道在新生毛细胞纤毛上的存在；⑤机械门控通道电流的出现,在功能上标志了再生的毛细胞已经具备了毛细胞的特性；⑥各种通道电流,动作电位在新生毛细胞上的有序出现,模拟了发育中的正常毛细胞的各种离子通道电流有序出现的过程,证实了Mathl诱导的新生毛细胞是未成熟的、正在发育中的,具有功能的毛细胞。
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