高效石油烃降解菌的分离、鉴定、菌群构建及其在生物修复中的强化作用的研究

论文摘要

本研究从长期受石油污染的土壤中分离筛选到三株石油烃高效广谱降解菌株,分别命名为W1、W2和W3。根据它们的形态观察、培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列的同源性分析等,将它们初步鉴定为红球菌属（Rhodococcus sp.）.对它们生物学特性研究结果显示,这3株石油烃降解菌都是革兰氏阳性菌,有球杆状变化;其中W1在LB上培养时,菌落呈橙色,W2和W3菌落呈杏黄色;3株菌的最适生长温度为30℃;最适pH值为6.0～8.0;都能耐受一定浓度（1～4%）的NaCl%和抗生素;对葡萄糖和蔗糖等单糖的利用要好于麦芽糖和淀粉,对蛋白胨、牛肉膏等有机氮源的利用明显优于硫酸铵等无机氮源。对它们降解性能研究结果显示,W1、W2、W3都能以正十八烷为唯一碳源生长,在含500mg/L正十八烷为唯一碳源的培养基中培养56h后正十八烷降解率分别达100%、96.9%、98.12%.W1、W2、W3降解正十八烷的最适温度为10～30℃,最适pH值为6.0～8.0,最适NaCl%（NaCl%）在0～5%的范围内变化都不大,在低温条件下仍具有良好的降解能力.W1、W2、W3都有着很宽的烷烃降解谱,能降解高浓度原油（5g/L）中C13-C32的直链烷烃.W1、W2、W3菌株对石油中C27-32降解率不高,但对C13～C26的降解率均达到了80%以上,其中W1对C13～C26的降解率达到了90%以上.W1对姥鲛烷和植烷的降解率在90%以上,W2则对这两种烷烃的降解率都在50%左右,而W3对姥鲛烷的降解率也接近40%,但不能降解植烷.W1在降解烷烃的同时能产生生物表面活性剂,使表面张力由60.5 mN/m下降到36.6mN/m,表明W1具有较强的乳化和分散石油的能力。通过对实验室已有的菌株和这3株菌株进行优化组合,构建出由菌株W1、W3、W4、W7组成的菌群D降解效果最好,在装液量100mL、总接种量1%、石油浓度5g/L的液体无机盐培养基中,5d内原油降解率达到了0.3%（重量法）、71.4%（紫外法）,复合菌群之间的相互协同作用使石油的降解作用大大提高。考察了菌群D在实验室模拟条件下对石油污染土壤的生物修复能力及其影响因素.该菌群D在灭菌土壤申的降解效果要略好于未灭菌土壤,在土壤中添加降解菌106CFU/g,温度10～30℃,pH为6.5～9.5的条件下,该菌群对土壤中原油（44.6g/kg）的降解率在60%左右,具有应用于实际石油污染土壤生物修复的潜力.

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述部分
• 1. 石油污染物的简介
• 2. 石油污染的危害及现状
• 3. 石油污染土壤的产生途径及治理方法
• 4. 石油污染土壤的微生物的修复
• 5. 石油烃类物质的微生物降解
• 6. 优势菌群的构建以及其在生物修复中的应用
• 7. 生物强化技术在生物修复中的应用
• 8. 石油烃含量的测定方法
• 9. 参考文献
• 实验部分
• 第一章 石油烃高效降解菌的分离与鉴定研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 土壤样品来源
• 1.2 培养基
• 1.3 菌株的富集和分离
• 1.4 菌株的16S rDNA序列测定
• 1.4.1 菌株基因组DNA提取
• 1.4.2 16S rDNA序列的PCR扩增
• 1.4.3 PCR扩增产物的纯化
• 1.4.4 16S rDNA片断与载体的连接
• 1.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.4.6 转化
• 1.4.7 转化子的验证
• 1.4.8 质粒的小量提取
• 1.4.9 16S rDNA序列的测定
• 1.5 生理生化实验
• 1.6 降解菌株系统发育地位的确定
• 2. 结果与分析
• 2.1 石油烃降解菌株的分离
• 2.2 降解菌株的形态、培养特征及生理生化特征
• 2.3 降解菌株的基因组DNA提取
• 2.4 降解菌株的鉴定结果及系统进化分析
• 2.5 环境条件对降解菌株生长的影响
• 2.5.1 pH对降解菌株生长的影响
• 2.5.2 温度对降解菌株生长的影响
• 2.5.3 通气量对降解菌株生长的影响
• 2.5.4 NaCl对降解菌株生长的影响
• 2.5.5 不同碳源对降解菌株生长的影响
• 2.5.6 不同氮源对降解菌株生长的影响
• 2.5.7 降解菌株的抗生素耐受情况
• 3. 结论
• 4. 参考文献
• 第二章 石油烃降解菌的降解特性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 供试菌株、培养基及试剂
• 1.2 菌株的培养及接种
• 1.3 分析测定方法
• 1.3.1 正十八烷烃含量的测定
• 1.3.2 原油降解率测定
• 1.3.3 石油中不同长度碳链烷烃的测定
• 1.3.4 表面张力的测定
• 1.3.5 菌体生长量的测定
• 1.4 菌株W1、W2、W3质粒alkB保守片段的PCR扩增
• 2. 结果与分析
• 2.1 降解菌株对原油的降解
• 2.2 降解菌株对原油中石油烃降解谱的测定
• 2.3 降解菌株的生长与正十八烷降解之间的关系
• 2.4 温度对降解菌株降解正十八烷的影响
• 2.5 pH对降解菌株降解正十八烷的影响
• 2.6 NaCl%对降解菌降解正十八烷的影响
• 2.7 降解菌株生长与培养基表面张力降低之间的关系
• 2.8 降解菌株的alkB基因保守片段的扩增
• 3. 结论和讨论
• 4. 参考文献
• 第三章 复合菌群的构建及对石油污染土壤修复
• 1. 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 试验土壤
• 1.3 优势菌群的构建
• 1.4 石油污染土壤强化修复模拟实验
• 1.5 土壤中石油的提取与测定
• 2. 结果与分析
• 2.1 降解菌株对石油中不同组分的降解
• 2.2 复合降解菌群的构建
• 2.3 复合菌剂对灭菌和未灭菌土壤中石油的降解
• 2.4 土壤pH对石油降解的影响
• 2.5 温度对石油降解的影响
• 2.6 接种量对石油降解的影响
• 3. 结论
• 4. 参考文献
• 全文总结
• 附录一: 相关DNA序列
• 附录二: 攻读硕士学位期间发表或已接收的论文
• 致谢