短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）XDH抗菌物质的发酵、分离纯化与结构鉴别

论文摘要

本试验室从泰山土壤中分离获得一株对多种病原菌具有较强拮抗作用的细菌—短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）XDH。本研究对XDH菌株抗细菌物质的发酵、分离纯化及其结构进行了研究,主要研究结果如下:通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、中心组合试验并结合响应面法确定了最佳发酵培养基配方为:葡萄糖15.6g/L、黄豆饼粉28.4g/L、淀粉6g/L、CaCO32g/L、MgSO4 4g/L;最佳发酵条件为种龄18h、接种量2%、发酵时间48h、装液量50mL、发酵温度31.1℃、转速212rpm、pH7.5。优化后发酵液效价达到了1419.30μg/mL,较初始发酵工艺（780.08μg/mL）提高了81.94%。抗菌物质粗物的最大吸收波长为210nm,茚三酮反应、双缩脲反应呈阳性,结合捷克八溶剂纸层析、pH纸层析结果,推测抗菌物质属于弱酸性物质,极有可能是肽类物质。通过硫酸铵盐析、CM Sepharose FF离子交换层析、Sephadex G25凝胶层析、AKTA Explore10高效液相层析系统对抗菌物质进行了分离纯化。结果为:CM Sepharose FF水洗样品得到至少两种物质,生测表明不具抗菌活性,而通过0～1mol/L Nacl梯度洗脱时得到一个峰,具有抗菌活性。收集该峰进行Sephadex G25凝胶层析,层析图谱中有两个色谱峰,表明至少含有两个组分,其中第一峰为有效峰,收集该峰,冷冻干燥后利用AKTAExplore10高效液相层析系统对其进行纯化,得到三种具有抗菌活性的物质,分别记为A、B、C组分;通过反相高相液相色谱对其中的B组分进行了检测,结果为单一峰,纯度为98.6%。利用质谱及核磁共振对B组分进行结构解析。一级质谱表明该组分的分子量为1570.9Da,结合二级质谱图推测其为肽类抗菌物质,其一级结构为:Ser-Ile/Leu-Tyr-Lys/Gln-Leu/Ile-Thr-Cys-Lys/Gln-Phe-469.54,其C末端含有一分子量为469.54的未知组分。已经获得了其核磁共振氢谱图,解谱工作正在进行中。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 统计优化技术在微生物发酵中的应用
• 1.1 均匀设计法
• 1.2 最陡爬坡法
• 1.3 析因设计法
• 1.3.1 全因子设计
• 1.3.2 部分因子设计
• 1.3.3 Plackett-Burman设计
• 1.4 响应面法
• 1.4.1 中心组合设计法
• 1.4.2 Box-Behnken设计法
• 2 层析技术在物质分离纯化中的应用
• 2.1 离子交换层析技术及其应用
• 2.2 凝胶层析技术及其应用
• 2.3 高效液相色谱技术及其应用
• 3 物质结构鉴别中常用的技术
• 3.1 紫外吸收光谱
• 3.2 红外吸收光谱
• 3.3 质谱
• 3.4 核磁共振
• 4 短短芽孢杆菌及其产生的抗菌物质
• 5 本研究的目的意义
• 第二章 短短芽孢杆菌XDH发酵培养基及发酵条件的优化
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 培养条件
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 抗菌物质效价的测定
• 1.5.1 双层平板的制备
• 1.5.2 效价的测定
• 1.6 XDH菌株发酵培养基优化试验
• 1.6.1 Plackett-Burman（PB）试验设计
• 1.6.2 最陡爬坡试验
• 1.6.3 中心组合试验设计
• 1.6.4 验证试验
• 1.7 XDH菌株发酵条件优化
• 1.7.1 Plackett-Burman试验设计
• 1.7.2 中心组合试验设计
• 1.7.3 验证试验
• 2 结果与分析
• 2.1 XDH菌株发酵培养基的优化
• 2.1.1 XDH菌株发酵主要影响因素的筛选
• 2.1.2 最陡爬坡试验
• 2.1.3 培养基的优化
• 2.1.4 优化结果的验证
• 2.2 XDH菌株发酵条件的优化
• 2.2.1 影响发酵产量的关键因子确定
• 2.2.2 关键因子对产量的影响
• 2.2.3 优化结果的验证
• 3 小结
• 第三章 短短芽孢杆菌XDH抗菌物质的分离纯化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 培养条件
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.1.5 主要试验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗菌物质生物活性的检测和效价的测定
• 1.2.2 抗菌物质的分离纯化
• 1.2.2.1 抗菌物质的硫酸铵盐析
• 1.2.2.2 抗菌物质的CM Sepharose FF离子交换柱层析
• 1.2.2.3 抗菌物质的Sephadex G-25柱层析
• 1.2.2.4 抗菌物质的HPLC色谱条件的选择
• 1.2.2.5 抗菌物质的制备高效液相色谱
• 2 结果与分析
• 2.1 抗菌物质的CM Sepharose FF离子交换层析结果
• 2.2 抗菌物质的Sephadex G25分子筛层析结果
• 2.3 抗菌物质的HPLC分析结果
• 2.4 抗菌物质的高效液相色谱制备结果
• 3 小结
• 第四章 短短芽孢杆菌XDH抗菌物质的性质研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 培养条件
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗菌物质粗物的全波长扫描
• 1.2.2 抗菌物质粗物的茚三酮反应和双缩脲反应
• 1.2.3 抗菌物质的捷克八溶剂纸层析
• 1.2.4 抗菌物质的pH纸层析
• 1.2.5 抗菌物质B组分的质谱及核磁共振测定
• 2 结果与讨论
• 2.1 抗菌物质粗物的紫外全扫描结果
• 2.2 抗菌物质粗物的茚三酮反应和双缩脲反应
• 2.3 抗菌物质的捷克八溶剂纸层析结果
• 2.4 抗菌物质的pH纸层析结果
• 2.5 抗菌物质B组分的质谱及核磁共振分析
• 3 小结
• 第五章 结论与讨论
• 1 讨论
• 1.1 抗菌物质发酵培养基与发酵条件的优化
• 1.2 抗菌物质的分离纯化
• 1.3 抗菌物质的性质研究
• 2 结论
• 2.1 抗菌物质发酵培养基与发酵条件的优化
• 2.2 抗菌物质的分离纯化
• 2.3 抗菌物质的性质研究
• 参考文献
• 附录一 试验中的源程序
• 1 响应面分析CCD试验设计SAS分析的源程序
• 2 HPLC分析程序文件
• 3 AKTA Explore10程序
• 附录二 微生物药物筛选流程
• 附录三 XDH菌株对几株病原菌的抑制效果
• 附录四 抗菌物质B组分的核磁共振氢谱
• 致谢
• 硕士期间发表论文