大马勃生药学及发酵工艺学的研究

论文摘要

大马勃Calvatia gigantea （Batsch ex Pets） Lloyd属马勃科药用真菌,本论文对大马勃进行了较系统的生药学研究,并采用生物发酵工程方法,开展大马勃菌种分离、纯化、选育,发酵工艺,化学成分含量测定及药理活性的研究,以期为大马勃的优质培育和资源开发提供实验依据和理论基础。将采集后的大马勃子实体进行了基源、性状、显微及理化鉴别。采用组织分离法对其斜面菌种进行分离、纯化和选育,通过对不同营养元素和培养条件的考核,筛选出生长旺盛,无杂菌污染的优良菌种,用于液体发酵工艺学的研究。在大马勃液体发酵工艺研究中首先对液体培养基的营养成分进行考核,其营养成分包括碳源、氮源、微量元素,再根据单因子实验结果设计正交试验L9（34）,筛选出最佳培养基配方；其次是对培养条件的考核,确定出最佳摇瓶装量、培养基初始pH值、培养温度、接种量；最后利用摇瓶菌种培养模拟大生产中发酵罐培养,考核了实验室生产发酵培养终止指标（菌丝湿重、干重、pH值、蛋白质含量、多糖含量、麦角甾醇含量）。当以大马勃中多糖为发酵代谢产物时,结合发酵过程中pH值、菌丝生物量等多项指标的分析,可以选择发酵第168h-第192h作为液体发酵终点,以麦角甾醇为代谢产物时,可以将第168h确定为发酵终点。利用紫外分光光度计法和高效液相色谱法法分别对大马勃子实体、大马勃发酵液、大马勃菌球中多糖及麦角甾醇进行含量测定,结果表明两种实验方法简单、准确,可作为质量控制的标准。本论文还通过抗炎镇痛及体外抑菌实验考察了大马勃子实体、大马勃发酵液、大马勃菌球的药理活性,三个样品都含有相同或相似的抗炎镇痛活性及抑菌活性,并且其中大马勃发酵液效果最佳,所以初步认为大马勃液体发酵得到的产物可代替大马勃子实体作为药用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 前言
• 文献综述
• 1 马勃属真菌的化学研究
• 1.1 马勃多糖
• 1.2 甾体化合物
• 1.3 生物碱
• 1.4 萜类化合物
• 1.5 其它成分
• 2 马勃属真菌的药用活性研究
• 2.1 抗炎作用研究
• 2.2 抑菌作用研究
• 2.3 止血作用研究
• 2.4 抗肿瘤作用研究
• 2.5 其他作用
• 3 临床应用
• 3.1 止血作用
• 3.2 治疗扁桃体炎
• 3.3 治疗癌症
• 3.4 治疗褥疮
• 4 培养特性研究
• 第一章 大马勃生药学研究
• 1.1 仪器与材料
• 1.1.1 实验仪器
• 1.1.2 实验材料
• 1.2 大马勃的鉴定
• 1.2.1 大马勃来源鉴别
• 1.2.2 大马勃性状鉴别
• 1.2.3 大马勃显微鉴别
• 1.2.3.1 大马勃临时装片的制备
• 1.2.3.2 大马勃的显微镜观察鉴别
• 1.2.4 大马勃薄层鉴别
• 1.2.4.1 供试品溶液的制备
• 1.2.4.2 对照药材溶液的制备
• 1.2.4.3 薄层色谱
• 1.3 结果分析
• 第二章 大马勃菌种的分离、纯化和选育
• 2.1 仪器与材料
• 2.2 大马勃菌种的分离纯化
• 2.3 大马勃菌种的选育
• 2.3.1 菌种
• 2.3.2 斜面母种的培养
• 2.3.3 培养基
• 2.3.4 菌丝培养观察指标
• 2.3.5 不同营养源对菌丝营养特性研究
• 2.3.5.1 对碳源的考察
• 2.3.5.2 对氮源的考察
• 2.3.5.3 对不同微量元素的考察
• 2.3.5.4 培养基优化试验
• 2.3.6 不同因素对菌丝生长的影响
• 2.3.6.1 对pH的考察
• 2.3.6.2 对温度的考察
• 2.3.7 大马勃稳定性试验
• 2.4 结果分析
• 2.4.1 不同营养对大马勃菌丝生长的影响
• 2.4.1.1 不同碳源对菌丝生长的影响
• 2.4.1.2 不同氮源对菌丝生长的影响
• 2.4.1.3 不同微量元素对菌丝生长的影响
• 2.4.1.4 正交优化试验对菌丝生长的影响
• 2.4.2 不同因素对大马勃菌丝生长的影响
• 2.4.2.1 不同pH对菌丝生长的影响
• 2.4.2.2 不同温度对菌丝生长的影响
• 2.4.3 大马勃菌株稳定性试验
• 第三章 大马勃菌种液体发酵工艺的研究
• 3.1 仪器与材料
• 3.2 液体菌种培养基的优化
• 3.2.1 液体菌种培养方法
• 3.2.2 液体菌种活力检测方法
• 3.2.2.1 菌种观察
• 3.2.2.2 发酵参数的测定
• 3.2.3 不同营养源对菌丝营养特性研究
• 3.2.3.1 对不同碳源的考察
• 3.2.3.2 对不同氮源的考察
• 3.2.3.3 不同微量元素的考察
• 3.2.4 对上述因素碳源、氮源、微量元素设计正交试验
• 3.3 液体菌种培养条件的优化
• 3.3.1 液体菌种培养方法
• 3.3.2 液体菌种活力检测方法
• 3.3.3 不同因素对菌丝生长的影响
• 3.3.3.1 发酵初始pH值对菌丝的影响
• 3.3.3.2 摇瓶装量对菌丝的影响
• 3.3.3.3 不同培养温度对菌丝的影响
• 3.3.3.4 不同接种量对菌丝的影响
• 3.4 摇瓶发酵培养终止指标
• 3.4.1 大马勃深层发酵工艺路线（实验室模拟试验）
• 3.4.2 发酵过程
• 3.4.3 培养终止指标
• 3.5 结果分析
• 3.5.1 不同营养源对菌丝生长的影响
• 3.5.1.1 碳源考察结果
• 3.5.1.2 氮源考察结果
• 3.5.1.3 微量元素考察结果
• 3.5.1.4 正交设计实验
• 3.5.2 不同培养条件对菌丝生长的影响
• 3.5.2.1 发酵初始pH考察结果
• 3.5.2.2 摇瓶装量考察结果
• 3.5.2.3 培养温度考察结果
• 3.5.2.4 不同接种量考察结果
• 3.5.2.5 液体菌种放罐指标考察结果
• 第四章 大马勃子实体、菌丝、发酵液中多糖及麦角甾醇含量测定
• 4.1 仪器与材料
• 4.2 大马勃子实体、菌丝、发酵液多糖含量测定
• 4.2.1 样品制备
• 4.2.1.1 对照品溶液的制备
• 4.2.1.2 供试品溶液的制备
• 4.2.1.3 方法条件
• 4.2.2 方法学的考察
• 4.2.2.1 线性关系的考察
• 4.2.2.2 精密度试验
• 4.2.2.3 稳定性试验
• 4.2.2.4 重复性试验
• 4.2.2.5 加样回收率实验
• 4.2.3 样品测定
• 4.3 大马勃子实体、菌丝、发酵液中麦角甾醇含量测定
• 4.3.1 样品的制备
• 4.3.1.1 标准品溶液的制备
• 4.3.1.2 供试品溶液的制备
• 4.3.2 色谱条件
• 4.3.3 方法学考察
• 4.3.3.1 标准曲线的绘制
• 4.3.3.2 精密度试验
• 4.3.3.3 稳定性试验
• 4.3.3.4 重复性试验
• 4.3.3.5 加样回收率试验
• 4.3.4 样品含量测定
• 4.4 结果分析
• 4.4.1 多糖含量测定
• 4.4.2 麦角甾醇含量测定
• 第五章 大马勃药理活性及体外抑菌实验的研究
• 5.1 大马勃子实体、菌丝、发酵液抗炎镇痛活性研究
• 5.1.1 材料与仪器
• 5.1.1.1 实验仪器
• 5.1.1.2 实验动物
• 5.1.1.3 实验试剂
• 5.1.1.4 实验药物
• 5.1.2 统计学方法
• 5.1.3 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
• 5.1.4 对醋酸所致小鼠的扭体反应的影响
• 5.2 大马勃体外抑菌活性的初步研究
• 5.2.1 材料与仪器
• 5.2.2 大马勃不同提取物的制备方法
• 5.2.2.1 大马勃子实体提取物的制备
• 5.2.2.2 大马勃菌丝体提取物的制备
• 5.2.2.3 大马勃发酵液提取物的制备
• 5.2.3 供试菌液的制备
• 5.2.4 抑菌滤纸片的制备
• 5.2.5 体外抑菌试验
• 5.2.5.1 抑菌圈的测定
• 5.2.5.2 采用试管稀释法对最低抑菌浓度（MIC）的测定
• 5.3 结果分析
• 5.3.1 大马勃子实体、菌丝体、发酵液抗炎镇痛活性研究
• 5.3.2 大马勃体外抑菌活性的初步研究
• 5.3.2.1 大马勃不同提取物的抑菌结果
• 5.3.2.2 大马勃不同提取物最小抑菌浓度结果
• 总结与讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录:Ⅰ
• 附录:Ⅱ
• 硕士期间论文发表情况