论文题目: 病毒诱导的基因沉默体系优化及烟草DHS基因功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 王宏芝
导师: 王国英
关键词: 病毒诱导基因沉默,基因功能
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 随着植物基因组计划的深入开展,研究重点已转向重要基因挖掘及功能鉴定。但目前尚缺乏有效的方法对DNA序列在植物体中的生物学功能进行大规模鉴定。近几年新发展的病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silence,VIGS)技术,可以利用携带目标基因的病毒载体侵染植物,诱导相关基因沉默,根据基因被抑制的表型推断目标基因的功能。由于VIGS技术操作简单,周期短,有望成为大量分析cDNA序列功能快速、有效的方法。 为了VIGS技术大规模应用于植物基因功能研究作好准备,以及探讨VIGS技术用于植物发育相关基因功能研究的可行性,本研究以PDS作为报告基因对农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系进行优化,并利用该系统研究了烟草(Nicotiana benthamiana)DHS(Deoxyhypusine Synthase)基因的功能,取得如下进展: 1.探讨了农杆菌接种浓度、接种植物的苗龄、病毒载体中插入片段与内源相关基因同源性对病毒诱导基因沉默效率的影响,结果显示一定范围内农杆菌接种浓度(OD值为0.6～2.0)对VIGS效率影响不明显;6叶龄幼苗是最佳接种时期,当接种苗龄大于6周的幼曲,无法诱导相关基因沉默;插入片段与内源相应基因的相似程度及完全一致片段的长度影响VIGS的发生效率。供试的4个巴旦杏(Prunus dulcis)同源片段,与烟草内源相关基因同源性分别为82-88%,均未产生预期的沉默症状。 2.利用VIGS系统,研究了烟草DHS基因的功能,成功获得DHS基因沉默表型。DHS抑制后植物表现多重反应,生长前期主要表现为生长增强,叶脉失绿,叶片叶绿素含量下降:后期植株的沉默表型有所分化,部分植株叶片自然衰老明显延迟,开花推迟;另一部分植株上部系统叶片失绿;极少数植株表现十分矮小,生长滞后。推测沉默表型分化与不同株系DHS基因被抑制的程度和持续时间及DHS靶蛋白elF-5A功能分化有关。此研究结果表明DHS基因参与多个生理过程,在植物生长与发育中起重要作用。可用于农作物、林木增产及园林绿化植物绿期延长的遗传改良研究及开发。本研究还证明,VIGS技术可用于植物发育相关基因的研究。
论文目录:
第一章 文献综述
第一节 病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组学研究中的应用
1 VIGS的发现
1．1 RNA介导的病毒抗性(RMD)的发现
1．2 VIGS的提出
2 VIGS技术原理和机制
2．1 VIGS是转录后基因沉默
2．2 VIGS的本质是植物体对病毒侵染的防御机制
3 VIGS技术应用于植物功能基因组学研究的原理
4 VIGS技术的发展和应用
4．1 VIGS技术的发展
4．2 VIGS技术成功应用于基因功能研究的植物种类和载体系统
5 VIGS技术应用于植物功能基因组学研究中的进展和应用前景
5．1 VIGS应用于植物基因功能研究的进展
5．2 VIGS技术在植物功能基因组学研究中的应用前景
第二节 DHS基因研究进展
1 eIF-5A与细胞增殖及衰亡相关
2 eIF-5A可能作为核质穿梭蛋白，参与mRNA核外运系统
第二章 农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系的优化
1 前言
2 材料与方法
2．1 实验材料
2．2 实验方法
2．2．1 TRIzol提取总RNA
2．2．2 PDS cDNA片段的克隆
2．2．3 重组马铃薯X组病毒载体向农杆菌导入
2．2．4 植物材料的感染
3 结果与分析
3．1 病毒诱导PDS基因沉默的表型分析
3．1．1 本生烟草及普通烟草PDScDNA片段的分离
3．1．2 含PDS报告基因重组病毒载体的构建
3．1．3 含重组病毒载体的农杆菌转化子的菌液PCR检测
3．1．4 PDS基因沉默表型分析
3．2 农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系的优化
3．2．1 接种农杆菌生长状态对VIGS效率的影响
3．2．2 接种植物苗龄对VIGS效率的影响
3．2．3 片段同源性对VIGS效率的影响
4 讨论
5 小结
第三章 利用病毒诱导基因沉默系统研究烟草DHS基因的功能
1 前言
2 材料与方法
2．1 实验材料
2．2 实验方法
2．2．1 TRIzol提取总RNA
2．2．2 DHS cDNA片段的克隆
2．2．3 病毒载体PVX-NbDHS构建及向农杆菌导入
2．2．4 植物材料的感染
2．2．5 半定量RT-PCR
2．2．6 Northern blot
2．2．7 蛋白质印迹分析
2．2．8 叶绿素含量测定
3 结果与分析
3．1 本生烟DHS cDNA片段的分离
3．1．1 cDNA片段的分离及序列同源比较
3．1．2 本生烟DHS基因拷贝数推测
3．2 病毒载体PVX-NbDHS构建及向农杆菌导入
3．3 PVX-NbDHS感染植株的DHS和eIF-5A基因表达水平分析
3．4 DHS沉默植株表型分析
3．4．1 DHS沉默对烟草生长的影响
3．4．2 DHS沉默对植物自然衰老的影响
3．4．3 DHS沉默对叶片叶绿素含量的影响
4 讨论
5 小结
第四章 总结与展望
参考文献
插图和附表清单
缩写词
致谢
在学期间发表的论文及承担科研项目
作者简介
发布时间: 2006-04-05
参考文献
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