鼠羧肽酶原B和蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase两种蛋白在毕赤酵母中表达研究

论文摘要

羧肽酶原B由胰腺细胞分泌,起初以含信号肽及前肽的前羧肽酶原B（preprocarboxypeptidase B）形式存在,在转运至内质网的过程中被信号肽酶切除掉信号肽而形成无活性的羧肽酶原B（procarboxypeptidase B,proCPB）,羧肽酶原B在小肠经胰蛋白酶特异水解剪切前肽后而被活化成羧肽酶B。羧肽酶B（carboxypeptidase B,CPB）是一类可水解蛋白或多肽底物C-端Lys或Arg的金属蛋白酶。羧肽酶B在科研上主要用于蛋白质、多肽的测序;在医学上用于诊断胰腺炎;另外,羧肽酶B是重组胰岛素的生产过程中不可缺少的一个工具酶。目前,商业途径获得的羧肽酶B主要从猪胰脏中提取,使得产品价格昂贵,同时也不可避免地混杂有其它蛋白酶,如胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶。除了从胰腺组织中直接提取外,羧肽酶B也可通过基因工程途径获得。Hartman等和Li等分别研究了鼠CPB在大肠杆菌中的原核表达。Eaton等和Ventura等曾在毕赤酵母（Pichia pastoris）中分别表达了人血浆羧肽酶原B和猪胰腺羧肽酶原B。王德解等利用巴斯德毕赤酵母pAOX1系统诱导表达了鼠羧肽酶原B,为探索利用GAP启动子（pGAP）取代AOX1启动子（pAOX1）的重组质粒在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中组成型表达鼠羧肽酶原B的可能性,本实验试图利用巴斯德毕赤酵母pGAP系统组成型表达鼠羧肽酶原B。本实验中,根据GAP启动子目的基因的序列设计上下游引物,应用PCR技术以质粒pIB2为模板扩增了GAP启动子基因片段,在目的基因的两端分别引入SacⅠ和BamHⅠ两个酶切位点,将GAP启动子基因片段取代诱导型质粒pPIC9K-proCPB上的AOX1启动子基因片段构建组成型表达质粒pGAPK-proCPB。用BglⅡ线性化pGAPK-proCPB重组质粒后,经电击转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,涂布MD平板,筛选出阳性菌落,在含0.2%的葡萄糖培养基中培养工程菌,首次实现了鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的组成型表达,并在α-因子信号肽的引导下成功地分泌到胞外。表达产物经过疏水、离子交换层析纯化后,获得了重组proCPB目的蛋白。Fibrolase是从美国南方铜头蛇——Agkistrodon contortrix contortrix的毒液中分离出来的一种锌金属蛋白酶;具有直接的纤溶活性,而无出血活性。Fibrolase由203个氨基酸残基组成,分子量23kDa,其完整的氨基酸序列已被确认,N-末端为环化的谷丙酰胺残基。Alfimeprase由201个氨基酸组成,是Fibrolase的N-末端突变体（前3个氨基酸EQR-被Ser取代）。这种改构避免Alfimeprase N-末端出现环化的谷氨酰胺残基。Alfimeprase与Fibrolase具有同样的溶栓功能,能专一降解纤维蛋白（原）。本实验中,采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达该锌金属蛋白酶。根据人工合成的Alfimeprase目的基因的序列设计其上下游引物,应用PCR技术扩增目的基因,在Alfimeprase目的基因的两端分别引入XhoⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点。将PCR产物插入pPIC9毕赤酵母表达质粒载体中,构建重组质粒pPIC9-ALF;用BglⅡ线性化pPIC9-ALF重组质粒后,经电击转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,涂布MD平板,筛选出阳性菌落。用终浓度1%的甲醇诱导pPIC9-ALF/GS115工程菌,表达Alfimeprase目的蛋白。另外,在Alfimeprase多克隆抗体的制备实验中,采用工程菌pET22b-ALF/BL21（DE3）用含氨苄青霉素的FML培养基,经乳糖诱导表达Alfimeprase目的蛋白。培养的工程菌菌体经超声破碎后,离心,洗涤、溶解包涵体。将纯化后的包涵体溶解液用弗氏佐剂乳化后,免疫BalB/C小鼠;共免疫三次,其中加强免疫两次。通过尾部取血和眼球取血的方法,获取小鼠血液;离心,获取血清,采用Elisa法检测获得的血清的效价。

论文目录

• 第一部分 用GAP启动子在毕赤酵母中的组成型表达鼠羧肽酶B
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 引物设计与合成
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 主要培养基
• 1.1.6 主要溶液
• 1.1.7 层析柱及纯化介质
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 GAP启动子基因的克隆与回收
• 1.2.2 质粒pPIC9k-proCPB的提取
• 1.2.3 pGAP片段和质粒pPIC9k-proCPB的双酶切
• 1.2.4 质粒pPIC9k-proCPB和pGAP片段双酶切产物的回收
• 1.2.5 双酶切回收产物的连接
• 1.2.6 大肠杆菌DH5α感受态的制备
• 1.2.7 连接产物转化大肠杆菌DH5α
• 1.2.8 菌落PCR筛选阳性克隆
• 1.2.9 质粒PCR鉴定及测序
• 1.2.10 巴斯德毕赤酵母GS115电转化与鉴定
• 1.2.11 重组子pGAPK-proCPB/GS115表达与分析
• 第二章 实验结果
• 2.1 重组质粒构建示意图
• 2.2 重组质粒的构建
• 2.3 毕赤酵母电击转化与鉴定
• 2.4 毕赤酵母重组子在摇瓶中的表达
• 2.4.1 毕赤酵母重组子的表达筛选
• 2.4.2 毕赤酵母重组子摇瓶培养时生长曲线的绘制
• 2.4.3 不同时间对目的蛋白表达的影响
• 2.5 目的蛋白表达产物的纯化
• 第三章 讨论
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.2 巴斯德毕赤酵母菌的转化
• 3.3 巴斯德毕赤酵母pAOX1系统与pGAP系统
• 3.4 巴斯德毕赤酵母组成型表达
• 3.5 目的蛋白的纯化
• 总结
• 参考文献
• 第二部分 蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的表达及多抗制备
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 引物设计与合成
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要培养基
• 2.1.6 实验动物
• 2.1.7 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组质粒pPIC9-Alfimeprase的提取
• 2.2.2 重组质粒PCR鉴定
• 2.2.3 毕赤酵母GS115电击转化与鉴定
• 2.2.4 酵母重组子pPIC9-Alfimeprase的诱导表达
• 2.2.5 Alfimeprase多克隆抗体的制备
• 第三章 实验结果
• 3.1 重组质粒pPIC9-Alfimeprase图谱
• 3.2 重组质粒的PCR鉴定及酶切
• 3.3 巴斯德毕赤酵母的电击转化与鉴定
• 3.4 毕赤酵母重组子的诱导表达
• 3.5 Alfimeprase包涵体蛋白的纯化
• 3.6 Alfimeprase包涵体的纯化样品浓度测定
• 3.7 Alfimeprase多抗效价测定
• 第四章 讨论
• 4.1 Alfimeprase在大肠杆菌表达系统中的表达
• 4.2 Alfimeprase在巴斯德毕赤酵母中pAOX1系统中的表达
• 4.3 Alfimeprase鼠多克隆抗体的制备
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢