失水胁迫下切花月季丝氨酸蛋白酶RhSep1基因相关研究

论文摘要

月季切花（Rosa Hybrida）在花卉市场具有较大的前景和需求量,但是由于月季切花的采摘、加工、运输等环节都会对切花造成失水胁迫,失水胁迫加速了月季切花的衰老过程,进一步影响了切花的寿命和质量,因此提高月季切花对失水胁迫的耐性具有实用性价值。根据对月季切花在失水胁迫过程中花瓣内肽酶的研究,其结果表明失水胁迫显著诱导了丝氨酸蛋白酶的活性。本文在已获得切花月季丝氨酸蛋白酶RhSep1基因序列的基础上,对RhSep1丝氨酸蛋白酶在切花月季失水胁迫过程中的作用进行探索。为了更好的开展后续研究,首先对切花月季丝氨酸蛋白酶RhSep1进行生物信息学分析,全面了解RhSep1的分子量、跨膜结构、疏水、信号肽、同源性,功能位点等可能的理化结构,为研究丝氨酸蛋白酶RhSep1在失水胁迫中的作用起到铺垫。将已获得的RhSep1基因重组到PET28a （+）载体中,构建重组表达载体,并转染到大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot结果表明丝氨酸蛋白酶降解严重,表达条件优化和更换菌种,均不能使目的蛋白明显表达。RhSep1基因相对荧光定量PCR表明RhSep1基因随着月季失水胁迫强度增加,表达也随之上升,但是该蛋白酶并不是失水胁迫诱导所产生。本实验所研究的内容提示了从切花月季花瓣中克隆出的RhSep1蛋白酶参于月季的失水胁迫生理,同时该酶的生化性质及在失水胁迫过程的作用有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物失水胁迫信号转导的分子基础
• 1.1.1 ABA受体：PYR/PYL/RCAR
• 1.1.2 ABA信号转导的负调控元件：PP2Cs蛋白
• 1.1.3 ABA信号转导的正调控元件：SnRK2s
• 1.1.4 各元件相互作用的结构基础
• 1.1.5 ABA信号转导的模式
• 1.2 提高植物失水胁迫抗性的研究进展
• 1.2.1 失水胁迫下外源物质对植物的影响
• 1.2.2 外源物质GSH对植物失水胁迫的影响
• 1.2.3 外源物质SA对植物失水胁迫的影响
• 1.2.4 外源物质甜菜碱对植物失水胁迫的影响
• 1.2.5 外源物质ABA对植物失水胁迫的影响
• 1.3 抗氧化酶有助于提高植物抗失水胁迫
• 1.4 内肽酶参与的植物逆境生理
• 1.5 丝氨酸蛋白酶与植物失水胁迫
• 1.5.1 丝氨酸蛋白酶在内肽酶中的突出表现
• 1.5.2 丝氨酸蛋白酶的作用
• 1.6 本课题研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基及试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 丝氨酸蛋白酶RhSep1基因生物信息学分析
• 2.2.2 丝氨酸蛋白酶RhSep1基因表达载体构建
• 2.2.3 重组质粒PET28a（+）-RhSep1转染
• 2.2.4 重组菌PET28a（+）-RhSep1-BL21（DE3）表达
• 2.2.5 丝氨酸蛋白酶RhSep1原核表达条件优化
• 2.2.6 实时定量PCR检测RhSep1表达水平
• 3 结果分析
• 3.1 丝氨酸蛋白酶RhSep1生物信息学分析结果
• 3.1.1 RhSep1序列信号肽分析
• 3.1.2 RhSep1疏水性分析
• 3.1.3 RhSep1蛋白质序列跨膜区分析
• 3.1.4 RhSep1蛋白同源性分析
• 3.1.5 RhSep1功能位点分析
• 3.1.6 RhSep1三级结构预测
• 3.2 丝氨酸蛋白酶RhSep1基因表达载体构建结果
• 3.2.1 RhSep1 DNA的制备结果
• 3.2.2 载体DNA的制备结果
• 3.2.3 pET-28a（+）-RhSep1测序结果
• 3.3 重组菌 PET28a（+）-RhSepI- BL21 （DE3）表达结果
• 3.4 重组菌pET-28a（+）-RhSep1-BL21（DE3）western blot结果
• 3.5 重组菌pET-28a（+）-RhSep1-BL21（DE3）诱导条件优化结果
• 3.6 实时定量PCR检测RhSep1表达水平分析
• 3.6.1 切花月季花瓣总RNA提取结果分析
• 3.6.2 管家基因ACTB检测结果
• 3.6.3 目的基因RhSep1检测结果
• 3.6.4 标准品和样品扩增曲线和融解曲线分析
• 3.6.5 目的基因的相对表达量（以CK-0h作为对照样品）
• 4 讨论
• 4.1 植物失水胁迫初期信号转导基础
• 4.2 丝氨酸蛋白酶RhSep1基因分析
• 4.3 RhSep1蛋白酶的异源表达
• 4.4 Real Time PCR确定目的基因RhSep1在失水胁迫下的相对表达量
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介