大豆酯酶同工酶的分离纯化及其对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感性的研究

论文摘要

自有机氯农药禁止使用后,作为替代品的有机磷、氨基甲酸酯类农药被广泛使用。但是由于我国制药技术落后和施药技术不规范,导致这两类农药中的高毒化学农药大量使用,不仅破坏农业生态环境,制约农业经济发展,同时因食用农药污染的食品所引起的食物中毒事件频频发生,带来了严重的食品安全问题。因此,急需研究和开发一些适合我国农产品产销特点的简便、快速、可靠、灵敏、实用的农药残留分析检测技术,将高农药残留的农产品杜绝于市场之外。酶抑制法具有需时短,成本低,技术要求不高等优点,易于在农产品生产基地和批发市场推广,适于现场快速检测。目前市场上的速测卡、检测箱、pH测量、传感器法及酶催化动力学光度法等都是基于酶抑制所建立起来的方法。植物酯酶酶原丰富,取材方便,对农药的敏感性与动物乙酰胆碱酯酶相当,因而近年来备受关注。本研究选用本实验室筛选的大豆酯酶作为农药快速检测用生物识别元件,对大豆中酯酶同工酶进行了分离纯化,制得纯的大豆酯酶同工酶制品,并分别研究了各种大豆酯酶同工酶的酶学特性及对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感性。研究内容及结果如下：（1）确定了大豆酯酶同工酶的分离纯化工艺路线。即：大豆种子粉碎后,按1：5料液比加0.3mol／L,pH 7.0的磷酸盐缓冲液,搅拌30min,4℃冰箱中浸提过夜,2-3层纱布过滤后,上清液依次进行1000r／min、2000r／min、4000r／min、6000r／min的差速冷冻离心,合并有酶活的部分,用60%硫酸铵盐析1h,沉淀溶解并透析,真空冷冻干燥制成酶粉,然后依次进行纤维素DEAE-32离子交换层析和葡聚糖Sephadex G-100凝胶过滤层析,分别收集酶活力峰,最终得到三种纯的大豆酯酶同工酶（Soybean Esterase isozyme, SEI）制品,分别记为SEI1,SEI2和SEI3。（2）对三种大豆酯酶同工酶的理化性质和动力学特性分别进行了研究。研究表明：SEI1的亚基相对分子量为40.7KDa；SEI2含有两种亚基,相对分子量分别为37.2KDa和21.4KDa；SEI3的亚基相对分子量为74.1KDa。三种酯酶催化底物α-乙酸奈酯的米氏常数Km分别为22.7μmol／L,58.6μmol／L和13.4μmol／L,最适温度分别为30℃,30℃和25℃,最适pH分别为6.5,6.0和6.5。三种大豆酯酶同工酶对α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯有催化能力,对乙酰胆碱和有机磷酸酯类化合物甲基对硫磷无催化能力。（3）考察了三种大豆酯酶同工酶的热稳定性、酸碱稳定性和保存稳定性,并确定了液态大豆酯酶同工酶的有效稳定保护剂。结果表明：SEI2的热稳定性好,SEI1和SEI3较差；三种酶的pH适应范围均较广,且碱性条件下相对稳定；三种酶在4℃的保存效果比—20℃好,且BSA、蔗糖和甘油可以有效地保护酶的稳定性,保存效果BSA>蔗糖>甘油。（4）研究了常见有机溶剂、金属离子、螯合剂及表面活性剂对三种大豆酯酶同工酶的影响。结果表明：乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、苯、正己烷等对酶的活性影响很大,且极性溶剂的影响大于非极性溶剂；金属离子除CaCl2外对三种酯酶均有很大的影响；螯合剂EDTA和表面活性剂SDS对三种酯酶均有抑制作用。（5）改进了分光光度法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测体系。即：1.45 mL的磷酸缓冲液中依次加入0.5 mL酶液和0.5 mL的农药,混匀后在30℃水浴中反应10 min,取出试管,加入50μLα-乙酸萘酯丙酮溶液,混匀,在30℃水浴中反应15 min,再加入0.5mL固兰B盐溶液,混匀放入30℃水浴中反应10min,然后在595 nm波长处测定吸光度,用缓冲液代替酶和农药作空白,调零。（6）进行了三种酯酶同工酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感性试验,结果表明：SEI2对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感性最好,SEI3其次,而SEI1无敏感性。故而选择SEI2作为快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物识别元件。

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摘要

ABSTRACT

第1章文献综述

1.农药和农药残留的危害

2.国内外食品农药残留的污染现状

2.1 国外食品农药残留污染现状

2.2 国内食品农药残留污染现状

3.食品中农药残留检测技术研究进展

3.1 常规仪器检测方法

3.1.1 气相色谱法（Gas Chromatography,GC）

3.1.2 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,简称HPLC）

3.1.3 超临界流体色谱（Supercritical Fluid Chromatography,简称SFC）

3.1.4 毛细管电泳（Capillary Electrophoresis,简称CE）

3.1.5 色谱—质谱联机（GCl/LC-mass spectrometry,GC/LC-MS）

3.1.6 薄层色谱法（thin-layer Chromatography,TLC）

3.1.7 毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis,简称CZE）

3.2 农药残留快速检测方法

3.2.1 酶联免疫检测法（ELISA）

3.2.2 酶抑制法

3.2.2.1 乙酰胆碱酯酶法

3.2.2.2 植物酯酶法

4.本课题研究的目的和意义

第2章正文

1.引言

2.材料和方法

2.1 试验材料与主要生化试剂

2.2 主要仪器和设备

2.3 试验方法

2.3.1 大豆酯酶活力测定方法

2.3.1.1 试剂的配制

2.3.1.2 α-萘酚标准曲线的绘制

2.3.1.3 大豆酯酶活力测定

2.3.2 蛋白质浓度测定方法

2.3.3 大豆酯酶的粗提

2.3.4 大豆酯酶的初步纯化

2.3.4.1 离心方法确定

2.3.4.2 硫酸铵盐析

2.3.4.3 真空冷冻干燥

2.3.5 大豆酯酶同工酶的进一步分离纯化

2.3.5.1 纤维素DEAE-32离子交换层析

2.3.5.2 葡聚糖Sephadex G-100凝胶过滤层析

2.3.大豆酯酶同工酶的纯度鉴定

2.3.6.1 变性SDS-PAGE

2.3.6.2 非变性PAGE

2.3.7 大豆酯酶同工酶的生化和动力学特性研究

2.3.7.1 大豆酯酶同工酶的相对分子量测定

2.3.7.2 大豆酯酶同工酶的最适反应条件测定

m及最大反应速度V_max测定'>2.3.7.3 大豆酯酶同工酶的米氏常数K_m及最大反应速度V_max测定

2.3.8 大豆酯酶同工酶的稳定性研究

2.3.8.1 大豆酯酶同工酶的热稳定性测定

2.3.8.2 大豆酯酶同工酶的酸碱稳定性测定

2.3.8.3 大豆酯酶同工酶的保存稳定性测定

2.3.8.4 大豆酯酶同工酶的最适保护剂研究

2.3.9 大豆酯酶同工酶的底物特异性研究

2.3.10 有机溶剂、金属离子、螯合剂及表面活性剂对大豆酯酶同工酶的影响

2.3.10.1 常见有机溶剂对大豆酯酶同工酶的影响

2.3.10.2 常见金属离子、螯合剂及表面活性剂对大豆酯酶同工酶的影响

2.3.11 大豆酯酶对农药敏感性的测定方法

3.结果与分析

3.1 大豆酯酶初步纯化条件的确定

3.1.1 离心条件的确定

3.1.2.1 初步纯化过程纯化表

3.1.2.2 初步纯化过程的SDS-PAGE电泳及同工酶电泳鉴定

3.2 大豆酯酶同工酶的进一步分离纯化

3.2.1 纤维素DEAE-32离子交换层析

3.2.2 葡聚糖Sephadex G-100凝胶过滤层析

3.3 大豆酯酶同工酶的非变性电泳鉴定

3.4 小结

3.5 大豆酯酶同工酶的特性研究

3.5.1 大豆酯酶同工酶的生化和动力学特性研究

3.5.1.1 大豆酯酶同工酶的相对分子量测定

3.5.1.2 大豆酯酶同工酶的最适反应条件测定

m及最大反应速度V_max测定'>3.5.1.3 大豆酯酶同工酶的米氏常数K_m及最大反应速度V_max测定

3.5.2 大豆酯酶同工酶的稳定性研究

3.5.2.1 大豆酯酶同工酶的热稳定性测定

3.5.2.2 大豆酯酶同工酶的酸碱稳定性测定

3.5.2.3 大豆酯酶同工酶的保存稳定性测定

3.5.3 大豆酯酶同工酶的底物特异性研究

3.5.4 有机溶剂对大豆酯酶同工酶的影响

3.5.5 金属离子对大豆酯酶同工酶的影响

3.5.6 螯合剂及表面活性剂对大豆酯酶同工酶的影响

3.5.7 小结

3.6 大豆酯酶同工酶对农药敏感性的研究

3.7 大豆酯酶同工酶的最适保护剂研究

4.讨论

4.1 关于大豆酯酶的纯化

4.2 关于大豆酯酶同工酶

4.3 关于大豆酯酶同工酶的分离及性质

4.4 关于有机溶剂对大豆酯酶同工酶的影响

4.5 关于金属离子及螯合剂对大豆酯酶同工酶的影响

4.6 关于大豆酯酶同工酶对农药的敏感性

4.7 关于三种大豆酯酶同工酶的分类

4.8 关于液态大豆酯酶保护剂的选择

第3章结论

1.确定了大豆酯酶同工酶的分离纯化工艺路线

2.研究了三种大豆酯酶同工酶的理化性质和动力学特性

3.考察了三种大豆酯酶同工酶的稳定性和底物特异性

4.常见有机溶剂、金属离子、螯合剂及表面活性剂对三种大豆酯酶同工酶的影响

5.改进了分光光度法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测体系

6.研究了三种大豆酯酶同工酶对农药的敏感性

参考文献

致谢

攻读学位期间研究成果

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