论文摘要
背景：强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis, AS）,是一种以附着点炎及韧带骨赘形成为主要病理特征的慢性进展性炎性疾病,该疾病最终导致进展性脊柱强直及活动受限。对于许多患者,服用NSAIDS可以缓解其疼痛症状,即使是NSAIDS不敏感患者,也大部分可以通过接受抗肿瘤坏死因子疗法明显改善疼痛症状及脊柱活动度。但是TNF拮抗疗法并不能阻止强直性脊柱炎患者骨结构的破坏包括骨侵蚀及骨赘形成。目前的研究提出假说认为早期诊断和治疗可能可以避免最终的骨化进展。但是诊断强直性脊柱炎主要依据1984年修改的纽约标准,故诊断需要基于临床症状体征的观察以及X片显示的骶髂关节骨结构的改变。但是出现X片显示的骶髂关节骨结构的改变需要等待若干年时间。目前发病至确诊平均约需6～10.5年,多数患者确诊时,骶髂关节、脊柱已出现骨化、强直,失去了早期治疗的机会。生物标志具有检测的便利性,寻找一种新的强直性脊柱炎疾病的生物标志,以便于强直性脊柱炎的早期诊断,确诊,监测强直性脊柱炎病理进展,评估治疗效果已经成为目前强直性脊柱炎研究新方向。为了量化强直性脊柱炎病理进程,影像评分是一种半定量的方法。传统的X片仍然是评价骨组织改变的金标准。目前常用的X片影像评分系统有BASRI （the Bath Ankylosing Spondylitis Radiology Index）、SASSS （the Stoke Ankylosing Spondylitis Spine Score）、mSASSS （the modified SASSS）, mSASSS被证明在记录强直性脊柱炎X影像进展中优于前三种评分系统。但是mSASSS需同时评价患者的颈椎、胸椎、腰椎,而实际临床工作中很大比例患者影像资料并不够如此齐全。SASSS评分对于影像资料要求最少,较易开展。基质Gla蛋白（Matrix C-carboxyglutamic acid Protein;Matrix Gla Protein, MGP）,是一种分子量为14 kD的低分子胞外基质蛋白,因含有5个可羧化γ-谷氨酸残基而得名,另外还带有多个可磷酸化的丝氨酸残基。MGP主要是由软骨细胞以及血管平滑肌细胞分泌,被证明可以抑制血管钙化及软骨成骨分化,但是仍然不知道每种组织对MGP血清MGP浓度的贡献程度。MGP的羧化或者磷酸化状态使得血液中存在多种MGP分子形式,包括磷酸化MGP[pMGP],非磷酸化MGP[dpMGP],羧化MGP[cMGP]或者非羧化MGP [ucMGP])。在局部组织中这些分子与钙的亲和力,以及对于钙化的抑制作用可能并不完全相同。同时MGP的羧化需要γ羧化酶的辅助,并需要维生素K作为辅助因子,具有维生素K依赖性。因此这些分子的在血液及局部组织中的浓度可以反映组织钙化情况以及系统或者局部维生素K的供应水平。Cranenburg E C等建立了针对ucMG以及dp-MGP、dp-ucMGP的ELISA检测方法,并发现心血管钙化越严重的人群如肾透析病人、冠脉成形、动脉瓣狭窄病人,ucMGP越低。目前尚无强直性脊柱炎病人血清或局部组织MGP蛋白水平的大样本临床研究,但有研究发现关节炎病人群体（包括5个强直性脊柱炎病人）总体表现出关节液与血液中ucMGP的分布异常。强直性脊柱炎骨赘形成主要以软骨化骨的方式进行。目前对MGP蛋白的研究已经揭示MGP蛋白对于异位钙化以及软骨化骨的负性调节作用。因为MGP蛋白的协调表达对于软骨化骨过程中软骨细胞的分化成熟以及矿物质沉积非常重要。MGP可以与羟基磷灰石的晶核结合重而阻止晶体生长。另外,Bostrom等研究发现,MGP与骨形成蛋白-2（BMP-2）结合形成复合物,抑制其生物活性,调节软骨细胞成熟及成骨分化。我们推测MGP可能参与强直性脊柱炎病理过程,尤其是骨重建病程。因此监测强直性脊柱炎病人dpMGP的血清浓度水平,并研究其与强直性脊柱炎影像学破坏,骨重建过程,炎症的关系,具有研究的必要性。目的：研究强直性脊柱炎（AS）患者人群血清dpMGP浓度水平及其诊断价值,探索dpMGP与强直性脊柱炎炎症与骨化病程的关系。方法：1.病人与对照的筛选该项研究有强直性脊柱炎患者82例,75例健康对照人群参与整个横断性对照研究过程,已淘汰部分失访以及资料欠缺的参与者。强直性脊柱炎患者及健康对照人群均为2010年1月至2013年1月南方医科大学医科大学附属珠江医院的门诊及住院的患者（具体纳入标准及排除标准见下）,或健康查体者。为了减少高龄性心血管钙化以及骨骼生长发育可能对血清dpMGP蛋白浓度的影响,我们将强直性脊柱炎患者及健康对照年龄限制在20-60岁以内。强直性脊柱炎病人符合修改的纽约诊断标准（1984年）,尽量避免因为强直性脊柱炎病情活动状态造成的选择偏倚。排除具有心血管疾病、慢性肾脏疾病、感染、其它风湿性疾病,以及正使用抗肿瘤坏死因子生物制剂、维生素K及其拮抗剂如华法林、维生素D等。对照组来自进行健康体检人群,无心血管疾病、无肝肾疾病,无风湿性疾病包括（AS）,无炎症及感染,目前无服用维生素K及其拮抗剂、维生素D。纳入研究的AS及对照组研究对象都能提供研究所涉及的各项临床资料及血清,否则予以排除。2. 临床评估收集强直性脊柱炎病人组及健康对照组临床资料,包括一般临床资料（年龄、性别、病程、体重指数（BMI））、影像资料（脊柱X双侧侧位片）、CRP浓度（免疫比浊法测定）、ESR。参照BASDAI （Bath AS Disease Activity Index）评分标准（0-10分）设计随访问卷,获得每个病人BASDAI评分。由3个具有影像专业知识背景的人士对病人脊柱X光侧位片进行独立阅片,按照SASSS（Stoke AS SpineScore）标准进行评分,最终分值为3方评分的平均值。3.血清保存及检测血样使用真空非抗凝管收集后在半小时内迅速保存于-20℃,并在1个月内通过离心（2400xg, 10min）获取上层血清后转移到-80℃长期保存。BALP、OC的血清浓度检测使用ELISA试剂盒操作按照试剂盒（NovaTeinBio, Massachusetts, USA）说明书进行。我们利用竞争性ELISA试剂盒（Biomedica, Vienna, Austria）检钡dpMGP。单克隆抗体（mAb-dpMGP315）以MGP的非磷酸化多肽序列SHESMESYELNPF （MGP3-15）为靶点,以mAb-dpMGP3-15为包被抗体,试剂盒中的微孔板预先已包被捕捉抗体,人工合成的dpMGP3-15多肽序歹SHESMESYELNPF （MGP3-15）作为标准品,其生物素标记形式b-dpMGP3-15是竞争性抗原,人工合成多肽序列利用单克隆抗体mAb-dpMGP3-15的特异性和生物素-亲和系统的放大效应对血清中的dpMGP水平进行检测。最低检测浓度为0.14nM。检测过程如下：100ul标准品或样品加入微孔板并孵育90分钟,37℃。吸去每孔液体,不冲洗。立即加入100ul生物素标记的竞争性抗原（b-mAb-dpMGP）,37℃孵育1小时。吸去液体,使用冲洗缓冲液洗板三次,每孔再加入100ul Streptavidin-HRPO。每孔加入TMP 90ul,37℃,孵育15分钟。然后避光保存,反应时间可根据孔板的颜色决定,但是不超过30分钟。当颜色梯度出现在标准孔,则使用终止液50ul终止反应。在波长450 nm光谱下ELISA读板仪读板,获得OD值。通过对比标准曲线得到dpMGP的浓度。4.统计分析使用spss16软件统计强直性脊柱炎病人及对照组各项指标的均数及方差,组间各项计量指标差异使用Mann-Whitney U检验,计数指标使用卡方检验。通过ROC （receiver operating characteristic）分析确定dpMGP作为强直性脊柱炎诊断指标的截断点,确定在该点的特异性、敏感性、AUC、似然比（LR）,诊断效力评级：AUC<0.7,低；0.7<AUC<0.9,中级；AUC>0.9,高。Spearman秩相关法检验dpMGP与各项血清及临床指标的相关性。P值小于0.01可认为具有显著性。为了分析dpMGP对于强直性脊柱炎患者骨结构破坏的诊断价值,我们界定了骨结构破坏的三个SASSS界值,利用ROC分析的方法分析在不同SASSS界值下dpMGP对于强直性脊柱炎骨结构破坏的诊断意义。为了便于更直观详细了解dpMGP对骨结构破坏的的诊断意义,我们绘制了三幅不同SASSS界值下以SASSS累计频率为横坐标,dpMGP为纵坐标的散点图,以分析其在不同SASSS界值下dpMGP诊断的真假阳性及阴性百分比。结果：1.强直性脊柱炎病人临床资料我们对82例AS病人的临床资料进行统计分析,并与75例健康对照比较。患者平均年龄38.8±8.9岁,平均病程12.7年。其中,男性69例,HLA-B27阳性70例。AS组年龄、性别、BMI、BALP、OC指标相比对照组差异不具有显著性：年龄(mean （SD）,38.8 （8.9） VS 44.1（3.1） years;性别（male%）,84% VS 80%; BMI （mean （SD））,22.7 （2.8） VS 24.3 （2.1） kg/m2。根据BASDAI评分标准以及SASSS评分分别对患者的疾病活动度以及影像破坏进行评分。得到患者BASDAI评分为3.9（2.2）（mean（SD））, SASSS评分为13.3（18.7）（mean （SD））,约有20例AS患者SASSS=0,约占样本总量的25%,中位数为4,最大值70。82例患者SASSS评分的分布特征可见其累积频率图。2.AS病人血清炎症及骨代谢相关因子浓度水平AS病人血清BALP、OC浓度水平与对照无明显差别：BALP （mean （SD）） 19.1 （5.3） VS 16.0 （6.0） IU/l; OC （mean （SD）） 12.1 （3.2） VS 8.9 （3.9） ng/mlo但是在ESR与CRP指标上,AS组比对照组明显要高,差异具有显著性：ESR （mean （SD））,33.5 （25.3） VS 9.7 （4.0） mm/h; CRP （mean （SD）） 8.7 （1.2） VS 1.7 （0.1） mg/dl（Table 1）。3.AS病人血清dpMGP浓度水平及其与年龄的关系对患者组按照年龄进行分组,标记为A组（20-40岁）,B组（40-60岁）。两分组的人数相同。利用竞争性ELISA法进行检测,以重复检测的平均值为最终结果。最终我们发现AS组dpMGP浓度（mean（SD）,9.2（2）nmol/l）低于对照组（mean （SD）,13.7（4.5））, p<0.01。（Picture2）,同样结果见于A组（mean （SD）,9.6 （2） nmol/1）及B组（mean （SD）,9（2.1）nmol/l）。4.AS血清dpMGP诊断价值我们进一步通过ROC曲线分析,以获得dpMGP的最佳截断点（cutoff point）,作为dpMGP诊断强直性脊柱炎的界值。最终我们确定dpMGP诊断界值为11.5nmol/l,可得到最优化的特异性（68%）及敏感性（88%）组合,youden指数（YI）为0.56,而此时的AUC （ROC, area under the curve）为0.81,诊断效力可评为中级,阳性似然比及阴性似然比分别为2.75,0.18。5. 血清dpMGP浓度与影像指标SASSS显著负性相关将dpMGP浓度与血清指标ESR、CRP、BALP、OC,临床评分指标BASDAI,影像评分指标SASSS进行相关分析。我们发现SASSS与dpMGP浓度存在显著负性相关（rs=-0.715,P<0.01）。6. 血清dpMGP浓度与影像指标SASSS关联的特征分析为了分析dpMGP与SASSS相关性的特点,我们先绘制了dpMGP-SASSS散点图。由图可以粗略判断dpMGP浓度与SASSS相关性是不均匀变化,SASSS较小时相关性不强,SASSS越大,相关性越明显。为此进行分区间分析,考虑SASSS取零值较多,因此排除掉SASSS取零值的病例。以SASSS=35为界值,将患者分2组,研究这些患者SASSS与dpMGP的联系。当0<SASSS<35时,可得到rs=-0.524,P值小于0.01。当35<SASSS<70时,rs=-0.73,P=0.03。很显然随着SASSS值的增大,dpMGP越小,两者的相关性越强。7. DpMGP对于强直性脊柱炎骨结构破坏的诊断价值我们利用ROC分析所得到的dpMGP对于不同SASSS界值定义的骨结构破坏的诊断价值。对于SASSS>0,>2,>4, AUC值分别为0.778,0.824,0.873,显然SASSS界值越大,dpMGP诊断的准确性越高。比较不同界值下dpMGP的阳性似然比,我们可发现, 当以SASSS>0为界值时LR+=6.56, LR-=0.42;而SASSS>4时,LR+=5.24, LR-=0.29。显然随着SASSS增大dpMGP诊断骨结构破坏阳性患者的准确性下降了,但是对于诊断骨结构破坏阴性患者的准确性提高了。通过绘制了三幅不同SASSS界值下以SASSS累计频率为横坐标,dpMGP为纵坐标的散点图,以分析其在不同界值下的真假阳性及阴性百分比。我们发现如果以一个更高SASSS界值（SASSS>4）用来区别骨结构破坏,真阳性的比例从52%降到37%,但是真阴性的比例却上升了（20%到43%）。假阳性的比例相差不大（6%到9%）,但是假阴性的比例变得更小（22%到13%）。真阳性和真阴性之和从72%升到80%,显然SASSS界值越大dpMGP鉴别出了更多的强直性脊柱炎患者有或者没有骨结构破坏。但是即使获得更高的诊断准确性,仍然有20%患者被错误地归类到有或者没有骨结构破坏。结论：1.血清dpMGP可作为一种新的用于强直性脊柱炎诊断的生物标志。2.血清dpMGP可作为强直性脊柱炎一种新的可指示骨重建病程的生物标志,尤其是在骨重建的晚期阶段。3. DpMGP在强直性脊柱炎骨重建过程可能扮演负性调节角色,而不是在其炎症阶段。