论文摘要
研究背景前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）在欧美等发达国家被列为男性最常见的恶性肿瘤,也是世界上男性死亡率继肺癌之后排名第二位的恶性肿瘤,占全部恶性肿瘤的28%。虽然我国前列腺癌的发病率和死亡率远低于欧美等发达国家,但随着人口老龄化的发展和PSA筛查的普及,前列腺癌的发病率呈逐年上升趋势,在男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤中发病率跃居第三位,成为威胁我国老年男性健康的一个重要因素。在我国,大部分前列腺癌患者往往初诊时就已为进展期,丧失了手术治疗的机会。雄激素去势（手术或药物）或联合雄激素阻断治疗和放射治疗是除外科手术治疗之外的应用较为广泛的治疗方法,我国前列腺癌治疗指南（2011版）中制定的内分泌药物治疗方法有单一抗雄激素治疗（Anti-androgen Monotherapy, AAM）、最大限度的雄激素阻断治疗（Maximal Androgen Blockade, MAB）、间歇内分泌治疗（Intermittent Hormonal Therapy, IHT）等,也是我国目前对于晚期前列腺癌的主要治疗方法。大多数患者刚开始接受去势（手术或药物）或联合雄激素阻断治疗时有效,经过14-30个月的中位缓解期后,几乎所有患者都将从雄激素依赖性前列腺癌（Androgen-Dependent Prostate Cancer, ADPC）逐渐发展为雄激素非依赖性前列腺癌（Androgen-Independent Prostate Cancer, AIPC）甚至激素难治性前列腺癌（Hormone-Refractory Prostate Cancer, HRPC）,其表现为前列腺癌细胞在缓解期过后又开始增殖,PSA进行性升高,对于AIPC的治疗非常棘手,目前仍无有效的治疗方法,极易发生骨转移,死亡率高,预后差,前列腺癌已成为危害老年男性人群健康的重大疾病。对AIPC的相关转变机制及治疗方法的研究和探索,是目前国内外前列腺癌研究领域的热点和难点。近年来研究证实,肿瘤细胞中许多基因启动子CpG岛表现出的异常高甲基化状态是肿瘤抑制基因失活机制中除突变、缺失和失活之外的第3种机制。抑癌基因的异常高甲基化可以直接或间接影响到基因的转录,使其表达受到抑制；而原癌基因的异常低甲基化却可使其表达得到活化,增加染色体的不稳定,使转位子异常表达,从而导致基因表达的异常、细胞的恶变,最终肿瘤的发生。DNA甲基化指的是在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, Adomet, SAM）为甲基供体,将甲基基团转移到CpG胞嘧啶中的5’碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, M5C）的过程。DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）是DNA甲基化过程中起关键作用的酶类,在体内主要负责细胞甲基化修饰的甲基化转移酶是DNMT1,维持性甲基化转移酶（maintenance methyltransferase）,它可以在亲代甲基化的DNA模板链的指导下使子代的DNA链的对应部分发生甲基化,是正常DNA复制过程中主要的甲基化修饰方式,DNMT和肿瘤的发生、发展有着密切的联系。谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-Transferases, GS-Ts）是一种二聚体同工酶,是体内生物转化最重要的II相代谢酶之一,也是具有解毒功能的三大酶系之一,具有强效的催化作用,其通过还原性谷胱甘肽与亲电子化合物结合从而对细胞内产生解毒作用。目前GSTS可以分为α、μ、π、σ、θ、κ、ζ和Ω8种亚型,其中GST-π被发现与肿瘤的发生关系密切,而GSTP1是GST-π的编码基因,它定位于染色体11q13,含有7个外显子和6个内含子,大量研究表明,前列腺癌细胞中由于GSTP1基因启动子区的甲基化而导致GSTP1的低表达甚至表达缺失,其基因功能的失活在前列腺癌的发生、发展中起着重要的作用。5-氮杂脱氧胞苷（5-Aza-CdR）属于阿扎胞苷脱氧核糖类似物,是核苷类的DNMT的抑制剂,它能在DNA复制的过程当中掺入到DNA中并被DNA甲基转移酶所识别,通过与DNMT的半胱氨酸残基上的巯基共价结合而使DNMT失活,从而降低细胞内DNMT的活性,降低基因启动子区域的高甲基化状态,恢复那部分失活基因的表达。研究目的基于以上研究基础,我们以DNMT和GSTP1作为研究的切入点,首先,我们通过去除雄激素依赖性的前列腺癌细胞LNCaP培养基内的雄激素并添加外源性抗雄激素药物,并通过长期传代培养诱导并建立雄激素非依赖性的前列腺细胞LNCaP-F60,来模拟前列腺癌患者在接受抗雄激素治疗后由激素依赖性向非依赖性转变过程。其次对该培育出的雄激素非依赖性前列腺癌细胞进行生物学鉴定及DNMT和GSTP1的蛋白表达、基因甲基化等检测,对其发生机制进行初步探讨,拟探明DNMT和GSTP1在前列腺癌在从雄激素依赖性向雄激素非依赖性转变过程中的作用及意义。第三,我们通过应用DNMT抑制剂5-Aza-CdR作用于激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-F60,再次检测作用后的前列腺癌细胞其雄激素依赖性和DNMT、GSTP1的蛋白表达及甲基化等情况,探讨DNMT抑制剂对于激素非依赖性前列腺癌的作用及机制,以望能为临床上对激素非依赖性前列腺癌的治疗寻找一条新的思路和突破点。主要研究内容1、激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP经长期在不含激素并添加适量抗雄激素药物的培养基内长期传代培养诱导并建立激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-F60。2、对前列腺癌细胞LNCaP-F60进行生物学鉴定,检测其细胞的侵袭性改变。3、对正常前列腺上皮细胞、LNCaP细胞和LNCaP-F60细胞分别检测其DNMT活性、DNMT1的表达、GSTP1基因的甲基化和GSTP1蛋白的表达水平的改变。4、通过检测细胞凋亡及细胞增殖活性得到5-Aza-CdR作用最佳浓度和时间,LNCaP-F60细胞经5-Aza-CdR作用后再次检测其雄激素依赖性、侵袭性改变以及DNMT活性、DNMT1mRNA的表达、GSTP1基因的甲基化和GSTP1蛋白的表达水平的改变。实验结果1、利用经过活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清和不含酚红的RPMI1640培养液并添加低浓度的氟他胺来模拟前列腺癌患者接受去雄激素治疗的细胞环境,后逐渐提高氟他胺药物浓度,传代培养60代后,细胞逐渐适应了外部细胞环境,能够正常增殖,诱导并建立了雄激素非依赖性前列腺癌细胞亚系LNCaP-F60。2、经相同培养基下培养相同时间后发现,LNCaP-F60细胞表现出较LNCaP细胞更强的生长能力,而Flutamide和DHT对于LNCaP-F60细胞的生长抑制和生长刺激作用均不明显,较LNCaP细胞表现出更强的侵袭性。3、在RWPE-1、LNCaP和LNCaP-F60三组细胞中DNMT活性、DNMT1mRNA的表达水平及GSTP1的甲基化水平依次上升,而其GSTP1的蛋白表达水平依次下降。4、经预实验后我们确定5-Aza-CdR的最佳作用浓度为10uM,最佳作用时间为2天,经5-Aza-CdR作用于雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-F60后的细胞我们称其为LNCaP-F60+5-Aza-CdR细胞,该细胞对于雄激素的依赖性得到部分恢复；经检测,该细胞的DNMT活性、DNMT1mRNA的表达及GSTP1的甲基化水平均降低,GSTP1的蛋白表达水平有了一定程度的恢复,同时经检测其细胞的侵袭性也降低。实验结论1、在去雄激素的培养环境以及氟他胺阻断的培养条件下,LNCaP细胞经过长期的传代培养后, LNCaP细胞从细胞形态和生物学行为上发生了改变,其细胞生长对于雄激素的依赖性降低,由此建立了雄激素非依赖性LNCaP-F60前列腺癌细胞模型,模拟了前列腺癌细胞由雄激素依赖性转变为雄激素非依赖性的过程。其对雄激素反应性和细胞生物学生长特性较父代LNCaP细胞之间存在明显的差异,为雄激素非依赖性前列腺癌发病机制的研究提供了良好的细胞学模型。2、在前列腺癌的发生、进展的过程中,DNMT活性、DNMT1mRNA的表达及GSTP1的甲基化起着促进或正向调节作用,其表达水平随着前列腺癌的进展而升高,与此相反,GSTP1蛋白的表达水平随着前列腺癌的进展而降低。3、5-Aza-CdR可以部分恢复雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-F60的雄激素依赖性,抑制其细胞的侵袭能力,可能通过抑制DNMT活性,抑制DNMT1的表达来降低GSTP1基因的甲基化水平从而重新激活GSTP1的功能,使GSTP1蛋白恢复表达。