论文摘要
第一部分体外实验——细胞实验第一节血管紧张素Ⅱ对NRK-52E中TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α表达的影响目的观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）后Toll样受体4（TLR4）、NF-κB、IL-6、TNF-α的表达变化,初步探讨AngⅡ对NRK-52E中TLR4及相关炎症分子表达的影响。方法①大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）分别按AngⅡ浓度梯度0（正常对照组）、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M培养24h,采用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）方法检测TLR4 mRNA表达水平。②根据①实验结果选择最佳AngⅡ干预浓度按时间梯度0（正常对照组）、6h、12h、24h、48h分组培养NRK-52E。RT-PCR检测TLR4mRNA表达水平,选择最佳AngⅡ干预时间点。③根据①②实验结果选择最佳AngⅡ干预浓度培养NRK-52E至最佳时间点,采用免疫细胞化学法检测NF-κB核易位活化情况,酶联免疫吸附法（ELISA）检测NRK-52E上清中IL-6、TNF-α的表达水平。结果①AngⅡ上调NRK-52E中TLR4 mRNA的表达呈剂量依耐关系,在时效关系上,10-7M AngⅡ作用6h后TLR4 mRNA即显著增高（较对照组比较P＜0.05）,12h～24h维持高峰水平,而48h后TLR4 mRNA表达逐渐减少。②10-7M AngⅡ作用NRK-52E 24h后可明显诱导NF-κB活化入核（较正常对照组P＜0.01）,NRK-52E上清中的IL-6、TNF-α分泌水平亦显著增高（较正常对照组P＜0.01）。结论AngⅡ可诱导NRK-52E中TLR4基因以及NF-κB、IL-6、TNF-a等炎性介质和细胞因子的表达上调。第二节TLR4-specific RNA干扰目的采用RNA干扰（RNAi）方法,观察沉默TLR4基因后AngⅡ诱导的NRK-52E中IL-6、TNF-a的表达以及NF-κB活化入核的变化,探讨TLR4与下游炎症因子之间是否存在相关关系。方法①分别建立稳定转染TLR4-specific RNAi质粒Si525、Si526及阴性对照质粒Si461的NRK-52E细胞株,RT-PCR、Western Blot检测转染后TLR4 mRNA和蛋白表达变化,验证RNAi质粒的沉默效率。②根据①选择沉默效率最佳的质粒转染细胞株,NRK-52E分四组:NRK-52E（正常对照组）、NRK-52E+AngⅡ(10-7M)、稳定转染TLR4-specific RNAi质粒的NRK-52E+AngⅡ(10-7M)、稳定转染阴性对照质粒的NRK-52E+AngⅡ(10-7M),培养24h进行实验。分别用RT-PCR和ELISA检测细胞IL-6、TNF-a mRNA表达及上清中的IL-6、TNF-a分泌水平;Western Blot和免疫细胞化学法检测NF-κB核蛋白表达水平以及核易位情况。结果①TLR4-specific RNAi质粒Si525、Si526对NRK-52E中TLR4mRNA和蛋白表达均有不同程度的抑制作用（P＜0.01或P＜0.05）,其中Si526基因沉默效率较Si525更高（P＜0.05）,阴性对照质粒Si461对TLR4的表达无明显影响,较正常对照组无统计学差异（P＞0.05）。②10-7M AngⅡ刺激稳定转染Si526的NRK-52E,24h后细胞IL-6、TNF-a mRNA表达水平以及上清中IL-6、TNF-a的蛋白分泌水平较刺激正常NRK-52E均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）,NF-κB核蛋白表达水平及核易位情况则无明显变化（P＞0.05）。结论AngⅡ诱导NRK-52E中IL-6、TNF-a的表达上调可随着特异性TLR4基因沉默而下降,研究结果证明了TLR4与下游炎症分子间存在密切关系,提示TLR4在高血压肾损伤中可能有诱导炎症因子生成的作用。而NF-κB的核活化未受明显影响,可能与AngⅡ可通过多种途径激活其活化有关。第三节Fosinopril、Losartan对NRK-52E中AngⅡ-TLR4-NF-κB-IL6/TNF-α信号转导通路的影响目的观察Fosinopril（Fos）和Losartan（Los）对AngⅡ诱导的NRK-52E中TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-a等因子的表达变化,从细胞微炎症反应角度探讨ACEI和AT1RB类药物对肾脏的保护作用机制。方法NRK-52E与干预药物共培养。实验分五组:正常对照组、NRK-52E+AngⅡ(10-7M)、NRK-52E+AngⅡ(10-7M)+Fos(10-5M)、NRK-52E+AngⅡ(10-7M)+Los(10-5M)、NRK-52E+AngⅡ(10-7M)+Fos(10-5M)+Los(10-5M),培养24h进行实验。RT-PCR检测TLR4、IL-6、TNF-a mRNA表达水平;Western Blot检测TLR4蛋白及NF-κB核蛋白表达;免疫细胞化学方法观察NF-κB核易位情况;ELISA检测细胞上清中的IL-6、TNF-a分泌水平。结果①Fos或/和Los干预AngⅡ诱导的NRK-52E,24h后与未干预组比较,其TLR4 mRNA及蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）;IL-6、TNF-a mRNA及细胞上清分泌水平均明显下调（P＜0.01或P＜0.05）;NF-κB核蛋白表达水平及核易位活化过程均被显著抑制（P＜0.01）。②Fos+Los联合用药组在下调TLR4及相关炎症介质、细胞因子方面与单用Fos组或Los组比较均无明显统计学差异（P＞0.05）。结论Fosinopril和Losartan可拮抗AngⅡ诱导的NRK-52E中TLR4mRNA及蛋白表达上调,抑制NF-κB核易位活化,从而阻断下游炎症分子IL-6、TNF-α的表达,提示ACEI/ARB在治疗高血压肾损伤时,除降压作用外可能还存在抗微炎症反应的作用。第二部分体内实验——动物实验TLR4基因在自发性高血压模型大鼠肾组织中的表达及Fosinopril和Losartan的干预作用研究目的采用Fosinopril和Losartan干预自发性高血压大鼠（SHR）模型,探讨肾素-血管紧张素系统（RAS）对TLR4基因表达的影响,以及TLR4基因在高血压肾损伤微炎症反应中的作用机制。方法20只22周龄雄性SHR,随机分为4组（5只/组）:高血压模型组（SHR组）,Fosinopril治疗组(Fos组,Fosinopril 10mg·kg-1·d-1灌胃),Losartan治疗组(Los组,Losartan 50mg·kg-1·d-1灌胃),Fosinopril+Losartan联合治疗组(Fos+Los组,Fosinopril 10mg·kg-1·d-1+Valsartan50mg·kg-1·d-1联合灌胃);另22周龄雄性Wistar-Kyoto大鼠5只为正常对照（WKY组）。SHR组及WKY组予等量蒸馏水清晨灌胃,各组大鼠均自由进食饮水,共喂养8周。检测各组大鼠体重、尾动脉血压、24h尿蛋白定量（Upro）、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG酶）、血尿素氮、血肌酐及左肾/体重比值。HE、Masson染色观察肾脏病理改变;RT-PCR检测肾组织中的TLR4、IL-6、TNF-a mRNA表达;Western Blot检测肾组织中的TLR4蛋白表达;酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清中的IL-6、TNF-a分泌水平。结果①实验前一般资料显示SHR收缩压、Upro及尿NAG酶均显著高于WKY大鼠（P＜0.05）,体重、血尿素氮、血肌酐等指标较WKY大鼠则无明显统计学差异（P＞0.05）。②Fos或/和Los干预SHR 8周后收缩压、Upro及尿NAG酶较未干预组均有明显降低（P＜0.05）。Fos+Los联合用药组较单用Fos或Los组无明显统计学差异（P＞0.05）。③SHR组大鼠肾脏出现高血压肾损伤的典型病理特征,并伴有小管间质的炎性细胞浸润,经Fos或/和Los干预后,高血压引起的肾脏病理改变明显改善,炎症浸润减轻。④SHR组大鼠TLR4、IL-6、TNF-a mRNA及蛋白表达水平较WKY组均明显增高（P＜0.05）,经Fos或/和Los干预后,TLR4及上述炎症因子的表达均显著下调（P＜0.05）,Fos+Los联合用药组较单用Fos或Los组无明显统计学差异（P＞0.05）。结论Fos和Los可下调SHR肾组织中TLR4基因的表达,降低相关炎症介质的水平,这可能是ACEI/ARB对抗高血压肾损伤的作用机制之一。
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