肝癌细胞粘附和收缩调节对Rho蛋白表达影响的实验研究

论文摘要

Rho蛋白是细胞内多条信号转导通路的关键分子,可参与对正常细胞增殖、分化、凋亡的调控,其表达受到细胞骨架功能状态的反馈调节。在肿瘤细胞中Rho蛋白表达普遍增高,Rho蛋白表达异常与肿瘤的发生和转移密切相关。由于肿瘤细胞骨架发育存在缺陷,由此导致的骨架功能异常与其Rho蛋白表达增高是否存在相关性。本课题研究细胞不同的粘附和收缩行为对Rho蛋白表达和细胞迁移运动特性的影响,从而探索肝癌细胞侵袭转移的过程机制。目的本文通过控制细胞粘附和收缩行为,比较正常肝细胞和肝癌细胞在不同预张力状态下其Rho蛋白表达变化的趋势,以及这种改变对细胞迁移、增殖特性的影响,这对揭示肝癌细胞迁移行为的胞内分子基础有一定意义。方法运用细胞形态学观察,免疫组织化学技术,分别对肝癌细胞,正常肝细胞Rho蛋白表达水平,以及FN裱衬前后肝癌细胞迁移运动能力进行检测和分析;通过免疫荧光实验技术对裱衬FN的不同粘附状态,用MLCK抑制剂ML-7作用下细胞的不同收缩状态,以及机械加载条件下肝癌细胞、正常肝细胞骨架变化和Rho蛋白表达分布进行检测和定量分析,从而了解细胞骨架结构功能状态对Rho蛋白表达分布的影响趋势,以及这些改变与肝癌细胞迁移增殖行为变化的相关性。结果（1）肝癌细胞Rho蛋白的基础水平高于正常肝细胞;裱衬1-5μg/ml FN肝癌细胞Rho蛋白表达水平升高,裱衬10-20μg/ml FN Rho蛋白表达水平下降,但裱衬40μg/ml FN Rho蛋白表达水平开始上调;而在正常肝细胞中裱衬FN后Rho蛋白表达水平显著降低;（2）随着裱衬FN浓度的增加,HepG2肝癌细胞粘附率增加,对增殖的抑制作用越发明显;（3）裱衬低浓度FN（2μg/ml）,细胞迁移运动能力明显增加,而高浓度FN（20μg/ml）时,细胞在1h的净位移和迁移轨迹离散度均减少;（4）MLCK抑制剂ML-7低浓度（6μM）使正常肝细胞Rho蛋白表达下调,而对肝癌细胞Rho蛋白无明显影响,ML-7高浓度（10μM）肝癌细胞骨架解聚,较正常细胞明显;两组细胞Rho蛋白表达减少;细胞迁移速率降低;（5）机械加载下细胞长短径比、球形指数、与主应变方向夹角均会发生变化,与静态对照组有明显差异;细胞骨架重排;肝癌细胞Rho蛋白表达明显增加。结论肝癌细胞Rho蛋白表达变化的反馈调节与细胞骨架结构和功能状态存在一定相关性,但其中不同粘附状态对肝癌细胞表达Rho蛋白的反馈调节作用存在一定程度的失调;Rho蛋白表达水平与其迁移能力呈正相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 国内外研究现状
• 1.1.1 肿瘤细胞与Rho 蛋白
• 1.1.2 肿瘤细胞粘附与收缩调节异常对其迁移行为的影响
• 1.1.3 Rho 蛋白与肿瘤细胞的粘附、迁移
• 1.1.4 Rho 蛋白在肿瘤侵袭转移诊断和治疗中的意义
• 1.2 问题的提出及研究意义
• 1.3 研究目的和研究内容
• 1.4 技术路线
• 2 肝癌细胞不同粘附状态与Rho 蛋白表达变化的相关性
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料、试剂和仪器设备
• 2.2.1 实验仪器与设备
• 2.2.2 实验材料
• 2.2.3 主要试剂的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养方法
• 2.3.2 裱衬 FN 对 HepG2 细胞粘附影响的测定
• 2.3.3 裱衬 FN 后对 HepG2 细胞增殖影响的测定
• 2.3.4 裱衬 FN 后对 HepG2 细胞迁移运动影响的测定
• 2.3.5 显微形态学观察
• 2.3.6 细胞迁移运动行为表征
• 2.3.7 免疫组织细胞化学法观察Rho 蛋白的表达、分布
• 2.3.8 免疫荧光技术观察裱衬FN对HepG2肝癌细胞和L02正常肝细胞Rho蛋白和细胞骨架的影响
• 2.3.9 数据分析方法
• 2.4 结果
• 2.4.1 人肝癌细胞株 HepG2 与正常肝细胞株L02 Rho 蛋白表达比较
• 2.4.2 裱衬不同浓度 FN 后对 HepG2 肝癌细胞粘附的影响
• 2.4.3 裱衬不同浓度 FN 后对 HepG2 肝癌细胞增殖的影响
• 2.4.4 裱衬FN 后对HepG2 肝癌细胞运动的影响
• 2.4.5 裱衬FN 对HepG2 肝癌细胞和L02 正常肝细胞Rho 蛋白和细胞骨架的影响
• 2.5 讨论
• 3 肝癌细胞骨架不同功能状态与Rho 蛋白表达变化的相关性
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料、试剂和仪器设备
• 3.2.1 实验仪器与设备
• 3.2.2 实验材料
• 3.2.3 主要试剂的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 显微形态学观察：同2.3.5
• 3.3.2 细胞形状变化几何参数分析
• 3.3.3 对细胞进行机械加载
• 3.3.4 细胞运动迁移行为表征：同2.3.6
• 3.3.5 免疫荧光技术观察细胞骨架不同功能状态对HepG2 肝癌细胞Rho 蛋白和细胞骨架的影响
• 3.3.6 数据分析方法
• 3.4 结果
• 3.4.1 细胞骨架不同功能状态对HepG2 肝癌细胞形态学的影响
• 3.4.2 ML-7 对HepG2 肝癌细胞迁移能力的影响
• 3.4.3 细胞骨架不同收缩状态对HepG2 肝癌细胞和L02 正常肝细胞Rho 蛋白和细胞骨架的影响
• 3.4.4 机械加载后对HepG2 肝癌细胞Rho 蛋白和细胞骨架的影响
• 3.5 讨论
• 4 结论及展望
• 4.1 全文主要研究工作及主要结论
• 4.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读硕士学位期间发表论文情况
• B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目情况