利用体外培养并诱导分化外周血单个核细胞获得内皮祖细胞构建组织工程化的毛细血管网

论文摘要

目的:探讨体外培养外周血单个核细胞,从而获得内皮祖细胞的方法及鉴定内皮祖细胞的方法。分析不同培养条件对内皮祖细胞增殖分化的影响;探讨构建三维组织工程化毛细血管网的方法,分析不同的种子细胞接种方法对内皮祖细胞在细胞支架上生长情况的影响。方法:细胞培养:抽取健康志愿者外周静脉血15ml样本24份,分为3组,其中实验组14份,对照1、2组各5份。用梯度密度离心法获取单个核细胞。实验组将获得的单个核细胞接种到表面包被有人纤维粘连蛋白的培养瓶中,并采用VEGF和bFGF诱导内皮祖细胞的增殖、分化;对照1组不采用生长因子诱导;对照2组将单个核细胞接种到无纤维粘连蛋白包被的培养瓶中。原代细胞培养12天后传代。观察各组各代细胞形态学的变化。通过细胞克隆形成计数、单克隆细胞计数及MTT比色法等方法检测各组细胞的增殖能力。对各组的原代细胞分别行CD34、CD133、Flk-1免疫组化染色,对各组的第3代细胞行CD31染色;对分离得到的单个核细胞及实验组的第1、2、3代细胞行CD34、CD133流式细胞学检测,对各组的原代及第3代细胞行CD31流式细胞学检测。对实验组第3代的细胞行DiI-AcLDL摄取实验及FITC-UEA-1结合实验。细胞-支架复合物的构建及动物实验:BALB/c裸鼠8只,以种子细胞接种方法的不同平均分为4组。实验Ⅰ组为支架吸收时间实验组（空白对照组）,不接种种子细胞;实验Ⅱ组为种子细胞全量接种组:实验Ⅲ组为种子细胞半量接种组;实验Ⅳ组为种子细胞全量多次接种组。使用粒子沥滤法构建HFN包被的PLGA支架。利用实验Ⅰ组的裸鼠动物模型检测支架吸收时间。将体外培养获得实验组第3代细胞接种到支架后,继续体外培养4周。扫描电镜检测内皮祖细胞在支架上生长情况。将实验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组得到的细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下,待支架完全吸收后,切取裸鼠术区皮肤及包含细胞-支架复合物的皮下组织,行HE、CD31免疫组化染色和扫描电镜检测,并对切片行存在内皮细胞的孔隙计数及内膜完整并内有红细胞存在的孔隙计数。结果:实验组培养获得的内皮祖细胞增殖分化能力明显强于对照1、2组。实验组第3代细胞中表达CD34+CD133+的的细胞较新分离的单个核细胞增加了79倍。实验组第3代细胞具有正常内皮系细胞的摄取DiI-acLDL,并结合FITC-UEA-1的生理功能。纤维粘连蛋白包被的PLGA支架在植入裸鼠皮下11周后被完全吸收。实验组第3代内皮祖细胞可以吸附并生长在生物可降解支架上。取材组织鉴定证明在细胞支架上可见存在内皮细胞生长的孔隙及内膜完整且内有红细胞存在的孔隙。这两种有效孔隙在实验Ⅳ组的细胞-支架复合物上形成最多。结论:体外培养外周血单个核细胞可以获得具有增殖和分化为内皮细胞能力的内皮祖细胞,其数量和质量均能满足作为构建组织工程化毛细血管网种子细胞的要求。内皮祖细胞的增殖速度及增殖能力和细胞克隆形成能力与是否包被纤维粘连蛋白和生长因子的存在与否均相关。是否包被纤维粘连蛋白与内皮祖细胞的分化无关,生长因子的存在使实验组大量的内皮祖细胞向内皮细胞方向分化;纤维粘连蛋白包被的PLGA支架的微结构、理化性质及吸收时间可以满足构建组织工程化毛细血管网的需要。内皮祖细胞可以生长在此生物可降解支架上。在一定范围内增加种子细胞的接种数量及多次接种同等数量内皮祖细胞可以促进内皮祖细胞在支架上生长的比例及内皮祖细胞分化得到的内皮细胞形成完整内膜的能力。

论文目录

• 目录
• 正文
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 一、毛细血管网的生理及组织学结构特点
• 二、毛细血管网与整形外科（理论意义）
• 三、构建组织工程化毛细血管网的选题依据
• 四、组织工程化毛细血管网的应用前景（实用价值）
• 第一部分:外周血中内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
• 1 材料和方法
• 2 实验结果
• 3 结论
• 4 讨论
• 实验图片
• 第二部分:三维组织工程化毛细血管网的预构建及初步动物实验
• 1 材料和方法
• 2 实验结果
• 3 结论
• 4 讨论
• 5 小结
• 实验图片
• 结语
• 参考文献
• 综述 内皮祖细胞与整形外科
• 致谢