立体选择性酰胺酶动力学拆分制备（S）-（＋）-2，2-二甲基环丙甲酸的研究

论文摘要

西司他丁是第一个应用临床的肾脱氢二肽酶抑制剂,它与亚胺培南的复方制剂——泰能特别适用于多种菌联合感染以及需氧菌和厌氧菌的混合感染,是目前临床用以治疗重症感染的首选药。西司他丁合成的关键中间体是S-2,2-二甲基环丙甲酸。本文以产S-酰胺酶的Bacillus cereus ZJB-07112为出发菌株,进行S-酰胺酶立体选择性动力学拆分制备S-2,2-二甲基环丙甲酸的研究。采用离子注入法对Bacillus cereus ZJB-07112进行诱变处理,结果表明,通过离子注入获得的突变株的酰胺酶活性有显著提高,其中突变株W60-31的酶活达62.14U/L,约为出发菌株的1.55倍。对突变株W60-31进行产酶条件的优化考察,W60-31菌株产酶的最佳碳、氮源是葡萄糖（15.8g╱L）,酵母粉（17.89g╱L）,最适初始pH值为7.5,最适培养温度为30℃,最佳诱导剂为3.47g╱L的2,2-二甲基环丙甲酰胺。研究了菌株W60-31的酶学性质及酶反应条件,该酶最适反应温度为35℃,最适反应pH值为8.2。W60-31的酰胺酶的热稳定性较好,30℃时的半衰期为83.5h,在40℃的半衰期为48.1h。反应过程中30 mmol/L底物浓度最好。对反应动力学进行了初步研究,得到Km的值为5.54mmol/L,Vmax的值为45.25μmol/min g。研究了以海藻酸钠为载体用包埋法制备固定化细胞的条件。结果通过条件优化,确定固定化细胞固定化时间为20h,底物浓度为30mmol/L,采用的海藻酸钠质量浓度为2.5%,氯化钙质量浓度为2.5%,最佳湿菌体含量为6%,最适转化体系为生理盐水,最适温度为35℃,转化15批后转化率为31.4%。本文以壳聚糖包埋法进行细胞的固定化,利用生物转化法将2,2-二甲基环丙甲酰胺立体选择性水解制备（S）-（+）-2,2-二甲基环丙甲酸。本实验研究了固定化细胞制备条件和固定化细胞最佳转化条件,这些参数如下:壳聚糖浓度为2.5%,交联剂三聚磷酸钠浓度为1%,最佳固定化时间为1.5h,最佳湿菌体含量为6%,最适反应体系为pH8.5的Tris-HC1缓冲液,最适反应温度为35℃,底物浓度为30 mmol/L时最佳反应时间为120min,在这些条件下,该固定化细胞反复使用17批后转化率为33.48%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 腈转化酶
• 1.3 酰胺酶
• 1.3.1 酰胺酶的来源及性质
• 1.3.2 酰胺酶的分类
• 1.3.3 酰胺酶酶催化反应的作用机理
• 1.4 西司他丁的概况
• 1.4.1 西司他丁简介
• 1.4.2 西司他丁的应用
• 1.4.3 西司他丁的合成方法
• 1.4.4 S-（+）-2，2-二甲基环丙甲酸（酰胺）的合成
• 1.4.4.1 不对称合成 S-（+）-2，2-二甲基环丙甲酸
• 1.4.4.2 合成2，2-二甲基环丙烷甲酸外消旋体
• 1.4.4.2.1 2，2-二甲基丙二醇为起始原料
• 1.4.4.2.2 2，2-二甲氧基环氧乙烷为起始原料
• 1.4.4.3 手性拆分制得S-（+）-2，2-二甲基环丙甲酰胺（甲酸）
• 1.4.4.3.1 化学拆分法
• 1.4.4.3.2 生物拆分法
• 1.5 微生物育种技术
• 1.5.1 微生物选育技术的现状及发展
• 1.5.1.1 从自然界分离筛选菌株
• 1.5.1.2 用物理、化学因子处理诱变菌株
• 1.5.2 离子注入育种技术
• 1.5.2.1 离子束研究进展
• 1.5.2.2 离子束生物工程学的应用进展
• 1.6 本课题研究背景、目的及意义
• 1.7 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 2，2-二甲基环丙甲酰胺 S-酶产生菌的选育及突变株产酶条件研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 化学试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 菌种
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 菌体培养
• 2.2.6 酰胺酶活力的测定
• 2.2.7 分析方法
• 2.2.8 离子束辐照装置
• 2.2.9 离子注入
• 2.2.10 低能离子注入工艺与样品处理
• 2.2.11 菌种的筛选
• 2.2.12 突变株稳定性考察
• 2.2.13 突变株产酶条件的优化
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 不同剂量与能量对存活率的的影响
• 2.3.2 诱变菌株的筛选
• 2.3.3 突变株的稳定性考察
• 2.3.4 突变株产酶条件的优化
• 2.3.4.1 碳源及其用量的对菌株产酶的影响
• 2.3.4.2 不同氮源对细胞活力的影响
• 2.3.4.3 不同金属离子对细胞活力的影响
• 2.3.4.4 不同添加剂对细胞活力的影响
• 2.3.4.5 采用Plackett-Burman（PB）设计和旋转中心组和实验设计对其培养基进行优化
• 2.3.4.5.1 全因子实验设计结果
• 2.3.5.5.2 响应曲面（RSM）实验设计
• 2.3.4.6 其它培养条件对菌体生长和产酶的影响
• 2.3.4.6.1 初始pH对菌体生长和产酶的影响
• 2.3.4.6.2 接种量对产酶的影响
• 2.3.4.6.3 摇瓶装液量对产酶的影响
• 2.3.4.6.4 培养温度对产酶的影响
• 2.3.4.7 间歇培养过程中菌体生长及产酶曲线
• 2.4 结论
• 参考文献
• 第三章 S-酰胺酶的酶学性质及2，2-二甲基环丙甲酰胺生物催化选择性水解反应研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种与培养基
• 3.2.2 细胞培养
• 3.2.3 静息细胞转化
• 3.2.4 分析方法
• 3.2.5 用手性毛细管气相色谱法测定底物、产物的的浓度时的浓度计算方法以及相关公式
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 有机共溶剂的选择
• 3.3.2 温度对酶反应的影响
• 3.3.3 底物浓度对酶反应的影响
• 3.3.4 pH值对酶反应的影响
• 3.3.5 反应动力学
• 3.3.6 动力学拆分
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第四章 海藻酸钠固定化产S-酰胺酶细胞的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 固定化材料
• 4.2.2 海藻酸钠固定化细胞的制备方法
• 4.2.3 固定化颗粒菌体量对酶活力的影响
• 4.2.4 海藻酸钠浓度对酶活力的影响
• 2浓度对酶活力的影响'>4.2.5 固定剂 CaCl₂浓度对酶活力的影响
• 4.2.6 固定时间对酶活力的影响
• 4.2.7 最佳转化体系的确定
• 4.2.8 固定化细胞反应最适温度
• 4.2.9 固定化细胞反应最佳底物浓度的确定
• 4.2.10 固定化细胞反应批次试验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 固定化菌体量对酶活力的影响
• 4.3.2 海藻酸钠浓度对酶活力的影响
• 2浓度的确定'>4.3.3 固定剂 CaCl₂浓度的确定
• 4.3.4 固定时间对酶活力影响
• 4.3.5 最佳转化体系的确定
• 4.3.6 固定化细胞反应最适温度
• 4.3.7 固定化细胞反应最佳底物浓度的确定
• 4.3.8 海藻酸钠固定化细胞最佳转化时间
• 4.3.9 固定化细胞反应批次试验
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 壳聚糖固定化产S-酰胺酶细胞的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 壳聚糖固定化细胞
• 5.2.2 固定化颗粒菌体量对酶活力的影响
• 5.2.3 固定化细胞反应最适pH的确定
• 5.2.4 壳聚糖浓度对酶活力的影响
• 5.2.5 固定剂三聚磷酸钠浓度对酶活力的影响
• 5.2.6 固定时间对酶活力的影响
• 5.2.7 固定化细胞反应最佳底物浓度的确定
• 5.2.8 固定化细胞反应批次试验
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 固定化菌体量对酶活力的影响
• 5.3.2 反应最适pH值的确定
• 5.3.3 壳聚糖浓度对酶活力的影响
• 5.3.4 固定剂三聚磷酸钠溶液浓度的确定
• 5.3.5 固定时间对酶活力的影响
• 5.3.6 固定化细胞反应最佳底物浓度的确定
• 5.3.7 壳聚糖电镜剖面图与表面图
• 5.3.8 固定化细胞反应批次
• 5.4 结论
• 参考文献
• 第六章 总结与建议
• 6.1 总结
• 6.2 建议
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢