蒙古冰草MwLEA3基因功能研究及MwRRT基因的克隆

论文摘要

蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）是禾本科冰草属小麦族多年生草本植物,不仅具有极高的饲用价值,而且具有很强的抗逆性,富含大量的抗旱、抗寒、耐盐基因,可以为牧草及近缘种作物（水稻、小麦、玉米等）的抗性改良及新品种选育提供宝贵的资源。本研究分离出蒙古冰草MwLEA3基因并进行了功能验证,并首次克隆得到了蒙古冰草类反转录转座子。主要研究结果如下:1.分离了蒙古冰草MwLEA3基因,其全长为705bp,开放阅读框为492bp,编码163个氨基酸。2.构建了蒙古冰草MwLEA3基因的亚细胞定位融合蛋白载体pA7-MwLEA3,并将此载体及pA7-GFP载体质粒转化至洋葱细胞中进行亚细胞定位。试验结果表明,pA7-MwLEA3融合蛋白集中分布在细胞核中,而对照pA7-GFP在整个细胞中均有分布,证明了MwLEA3基因表达的蛋白是核定位蛋白。3.成功构建蒙古冰草MwLEA3基因植物表达载体pCAM-MwLEA3,并经农杆菌介导进行烟草的遗传转化。对经过抗性检测的转基因烟草T0代植株进行PCR检测、PCR-Southern、RT-PCR鉴定以及干旱胁迫试验。分子检测结果表明,MwLEA3基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平正常表达;干旱胁迫试验结果显示转基因烟草植株的抗旱性高于野生型烟草植株。4.对10个株系转基因烟草T1代的卡那霉素抗性进行研究表明,10个株系中,有7个株系的T1代的分离比例为3:l,符合孟德尔式遗传规律,这表明MwLEA3基因是单拷贝插入;另外3个株系的T1代不符合孟德尔式3:1的遗传规律,说明这些植株中的MwLEA3基因可能是多个拷贝插入的。5.构建了35S启动子调控的具有MwLEA3基因反向重复结构的ihpRNA表达载体pART27-MwLEA3（HB）-MwLEA3（EX）,并通过冻融法转化将MwLEA3基因的ihpRNA表达框架成功导入根癌农杆菌LBA4404中。利用带有目的表达载体的农杆菌菌液侵染蒙古冰草愈伤组织,现正在筛选分化培养基上培养,后续试验正在进行中。6.首次克隆得到了蒙古冰草类反转录转座子（MwRRT）基因,该基因片段长度为1005bp,在1～225bp为非编码区,长度为225bp,其氨基酸序列在226～1005bp,共780bp,编码260个氨基酸。核苷酸及氨基酸同源性对比分析发现,所克隆基因与小麦（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、大麦（Hordeum vulgare）、高粱（Sorghum bicolor）的LTR类反转录转座子的核苷酸同源性约70%,氨基酸同源性约50%,GenBank登陆号NO.GQ855806.1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 蒙古冰草概况
• 1.1.1 蒙古冰草的植物学及生物学特征
• 1.1.2 蒙古冰草研究进展
• 1.2 胚胎晚期丰富（LEA）蛋白概述
• 1.2.1 LEA 蛋白的分类及结构
• 1.2.2 LEA 蛋白的定位
• 1.3 RNA 干扰技术
• 1.3.1 RNAi 的发现
• 1.3.2 RNAi 的作用机制及特点
• 1.3.3 RNAi 在植物基因功能研究中的应用
• 1.4 植物转基因技术
• 1.4.1 农杆菌介导转化方法
• 1.4.2 基因枪转化法
• 1.4.3 种质系统法
• 1.4.4 聚乙二醇法
• 1.4.5 电击法
• 1.4.6 超声波法
• 1.5 转基因植物的检测与鉴定
• 1.5.1 植物基因工程中常用的报告基因
• 1.5.2 植物基因工程中常用的选择基因
• 1.5.3 PCR 检测
• 1.5.4 斑点杂交和 Southern 杂交检测
• 1.5.5 Northern 杂交或RT-PCR 检测
• 1.5.6 Western 杂交或酶联免疫技术（ELISA）
• 1.6 本研究的目的意义及内容
• 2 蒙古冰草 MwLEA3 基因的分离
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒及菌株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 蒙古冰草总RNA 的提取
• 2.2.3 MwLEA3 基因的 RT-PCR 扩增
• 2.2.4 PCR 扩增产物的回收
• 2.2.5 PCR 产物的克隆
• 2.2.6 重组质粒的检测
• 2.2.7 测序
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 MwLEA3 基因的 RT-PCR 扩增
• 2.3.2 重组质粒的PCR 检测
• 2.3.3 重组质粒的酶切检测
• 2.3.4 测序结果分析
• 2.4 小结
• 2.5 讨论
• 3 蒙古冰草MwLEA3 基因的亚细胞定位
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 质粒及菌株
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 MwLEA3 基因的分离
• 3.2.3 MwLEA3 基因亚细胞定位融合蛋白载体的构建
• 3.2.4 基因枪法转化洋葱细胞及检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 MwLEA3 基因的分离
• 3.3.2 MwLEA3 基因亚细胞定位的融合蛋白载体构建
• 3.3.3 蒙古冰草MwLEA3 基因的亚细胞定位
• 3.4 小结
• 3.5 讨论
• 4 蒙古冰草MwLEA3 基因遗传转化烟草及功能研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株及载体
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.3 PCR 产物的克隆及测序
• 4.2.4 植物表达载体构建
• 4.2.5 植物表达载体的农杆菌转化及鉴定
• 4.2.6 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化
• 4.2.7 转基因烟草植株的 PCR 检测
• 4.2.8 转基因烟草的 PCR-Southern 检测
• 4.2.9 转基因烟草的 RT-PCR 检测
• 0代的抗旱性分析'>4.2.10 转基因烟草 T₀代的抗旱性分析
• 1代抗生素抗性检测'>4.2.11 转基因烟草 T₁代抗生素抗性检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 植物表达载体pCAM-MwLEA3 的构建
• 4.3.2 植物表达载体的农杆菌转化及鉴定
• 4.3.3 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化
• 4.3.4 转基因烟草植株的 PCR 检测
• 4.3.5 转基因烟草植株的 PCR-Southern 检测
• 4.3.6 转基因烟草的 RT-PCR 检测
• 4.3.7 转基因烟草植株的抗旱性分析
• 4.3.8 转基因烟草 T1代卡那霉素抗性检测
• 4.4 小结
• 4.5 讨论
• 4.5.1 植物表达载体的构建
• 4.5.2 转 MwLEA3 基因植株分子水平的检测
• 4.5.3 蒙古冰草 MwLEA3 基因功能验证
• 5 蒙古冰草 MwLEA3 基因ihpRNA 表达载体构建及遗传转化
• 5.1 材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 质粒和菌株
• 5.1.3 主要试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 蒙古冰草 MwLEA3 基因部分片段的分离
• 5.2.2 ihpRNA 表达载体的构建与鉴定
• 5.2.3 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 5.2.4 冻融法转化及鉴定
• 5.2.5 蒙古冰草愈伤组织诱导
• 5.2.6 蒙古冰草的遗传转化
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 蒙古冰草MwLEA3 基因部分片段的分离
• 5.3.2 ihpRNA 表达载体的构建与鉴定
• 5.3.3 ihpRNA 表达载体转化根癌农杆菌及检测
• 5.3.4 蒙古冰草愈伤组织诱导及转化
• 5.4 小结
• 5.5 讨论
• 5.5.1 基因功能的反向遗传学研究
• 5.5.2 农杆菌转化蒙古冰草
• 6 蒙古冰草基因组类反转录转座子基因同源序列的克隆与序列分析
• 6.1 材料
• 6.1.1 植物材料
• 6.1.2 菌株、质粒及主要试剂
• 6.2 方法
• 6.2.1 蒙古冰草基因组DNA 的提取
• 6.2.2 目的基因片段的扩增与回收
• 6.2.3 目的基因片段的克隆与转化
• 6.2.4 PCR 鉴定阳性重组质粒
• 6.2.5 目的片段的测序分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 蒙古冰草反转录转座子基因片段的获得
• 6.3.2 测序结果及序列分析
• 6.4 小结
• 6.5 讨论
• 7 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介