赤霉素合成酶基因沉默诱导植物矮化的研究

论文摘要

矮化和盆栽的木本花卉植物在园林绿化、室内装潢等方面有着重要作用,现有的木本花卉主要以乔木和小乔木为多。在控制木本花卉高生长的因素中,赤霉素合成酶（GA20-oxidase）通过反馈调节赤霉素含量,影响植物的高生长,是最重要的内源影响因子之一。本研究利用反义RNA及RNA干扰技术,在烟草上对GA20-oxidase基因的表达进行抑制,为最终实现木本花卉植物矮化性状的基因工程遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.从cDNA中克隆烟草NtGA20ox基因,构建了以NPTⅡ为标记基因的反义载体pBIantiW和RNA干扰载体pBIRNAiW;从载体pGEX-4T-2中克隆PttGA20ox基因,构建了以抗除草剂bar基因为标记基因的反义载体pBIbarantiG和RNA干扰载体pBIbarRNAiG。将四个载体转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中。2.建立并优化普通烟草W38及转基因烟草GW（转化超量表达PttGA20ox基因）的再生和遗传转化体系。继代培养基:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂5.5g/L;生根培养基:1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+琼脂5.5 g/L;分化培养基:MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂4.8 g/L。3.建立最优遗传转化程序。通过选择剂敏感性试验,确立了叶片不定芽诱导的选择剂浓度为:Kan 75 mg/L,Glu 0.5 mg/L。茎段增殖和生根的选择剂浓度为Kan150 mg/L,Glu 1.0 mg/L。结合Cef对农杆菌的抑菌效果,在遗传转化和再生、扩繁、生根时都选择250 mg/L为最适抑制浓度。对预培养时间、菌液侵染时间、菌液浓度、共培养时间、延迟选择时间、AS浓度等影响转化的因素进行研究,结果表明,预培养时间、延迟选择时间、AS浓度对转化的影响不大;当菌液浓度OD600=0.6时,10～15 min为比较合适的菌液侵染时间,此时抗性芽的转化效率最高;共培养最适宜时间为2 d。4.对四种转化苗烟草AW（转反义NtGA20ox基因）、烟草RW（转反向重复NtGA20ox基因）、烟草AG（转反义PttGA20ox基因）、烟草RG（转反向重复PttGA20ox基因）进行叶片的再分化培养检测和分子生物学鉴定,证明目的片段已经插入到转基因植株基因组DNA中。5.对转基因植株进行移栽和表型性状的统计与观测。转基因植株AW、GW与对照W38相比,明显矮化,茎段增粗,节间距变短,叶片变大,生根时间推迟且根数量相对稀少。转基因植株AG、RG与对照GW相比也呈现矮化状态,节间距明显缩短,茎段粗细变化不明显,叶片细长与对照相似,根稀少,生根时间推迟。6.对转基因植株进行细胞学比较。显微观察显示,转基因植株在细胞层面上与对照植株有显著差异,生长初期叶片细胞更为致密,茎段细胞长度小于对照,实施RNA干扰的细胞甚至成为椭圆形,细胞长度远远小于对照。7.对转基因植株进行内源激素含量的测定,并对转化苗进行外源GA喷施实验。内源激素测定结果表明,转化苗体内ABA、ZR的含量与对照相比没有显著差异,而其体内的IAA、GA3、GA4含量明显低于对照。外源GA喷施实验表明,转基因造成的GA含量降低是可逆转的,外源GA的喷施,可以提高植株体内GA的含量,使转基因植株的矮化状态得到恢复。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 相关研究进展
• 1.2.1 反义RNA及RNA干扰技术的研究进展
• 1.2.1.1 反义RNA技术
• 1.2.1.2 RNA干扰技术
• 1.2.2 根癌农杆菌Ti质粒及其标记基因的研究进展
• 1.2.3 赤霉素与植物矮化的研究进展
• 1.2.3.1 赤霉素的生物合成
• 1.2.3.2 影响赤霉素生物合成的关键酶和基因
• 1.2.3.3 赤霉素生物合成的调控
• 1.2.3.4 赤霉素对植株矮化的影响
• 1.3 研究的总体思路
• 2 植物反义与RNAi表达载体的构建
• 2.1 植物NtGA20ox基因反义与RNAi载体构建
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 菌株、质粒及植物材料
• 2.1.1.2 酶和试剂
• 2.1.1.3 主要仪器设备
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 总RNA的提取
• 2.1.2.2 RNA的RT-PCR
• 2.1.2.3 PCR产物重组入puc118载体
• 2.1.2.4 DNA序列测序及分析
• 2.1.2.5 质粒提取
• 2.1.2.6 农杆菌LBA4404感受态细胞的制备
• 2.1.2.7 液氮冻融法直接转化农杆菌
• 2.1.2.8 表达载体中插入的基因片段的引物设计及扩增
• 2.1.2.9 扩增产物的克隆及测序
• 2.1.2.10 NtGA20ox基因反义植物表达载体的构建
• 2.1.2.11 NtGA20ox基因RNAi植物表达载体的构建
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 总RNA的提取
• 2.1.3.2 PCR检测目的基因阳性克隆
• 2.1.3.3 目的基因的序列分析
• 2.1.3.4 含特异酶切位点插入片段阳性克隆的PCR及测序
• 2.1.3.5 反义载体pBIantiW的PCR及酶切鉴定
• 2.1.3.6 RNAi载体pBIRNAiW的酶切鉴定
• 2.1.3.7 表达载体导入根癌农杆菌LBA4404及其鉴定
• 2.2 转基因植物PttGA20ox基因反义与RNAi载体构建
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 目的基因片段的PCR引物设计及扩增
• 2.2.2.2 扩增产物的克隆及测序
• 2.2.2.3 中间载体pBIbarM的构建
• 2.2.2.4 PttGA20ox基因反义植物表达载体的构建
• 2.2.2.5 PttGA20ox基因RNAi栽体的构建
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 含特异酶切位点插入片段阳性克隆的PCR及测序
• 2.2.3.2 目的基因PttGA20ox的序列分析
• 2.2.3.3 中间载体pBIbarM的PCR及酶切鉴定
• 2.2.3.4 反义载体pBIbarantiG的PCR及酶切鉴定
• 2.2.3.5 RNAi载体pBIbarRNAiG的酶切鉴定
• 2.2.3.6 表达载体导入根癌农杆菌LBA4404及其鉴定
• 2.3 讨论
• 3 农杆菌介导表达载体的遗传转化
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 农杆菌与质粒
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 处理方法
• 3.2.1.1 植物材料的处理
• 3.2.1.2 农杆菌的活化培养
• 3.2.1.3 农杆菌介导的遗传转化程序
• 3.2.2 基本培养基配方
• 3.2.3 转化体系中抗生素与除草剂浓度实验
• 3.2.3.1 不同浓度对农杆菌的抑制
• 3.2.3.2 不同浓度对叶片不定芽分化的影响
• 3.2.3.3 不同浓度对茎段增殖的影响
• 3.2.3.4 不同浓度对组培苗生根的影响
• 3.2.3.5 评价指标
• 3.2.4 影响转化效果的因素筛选
• 3.2.4.1 预培养时间
• 3.2.4.2 菌液侵染时间
• 3.2.4.3 菌液浓度
• 3.2.4.4 共培养时间
• 3.2.4.5 延迟选择
• 3.2.4.6 乙酰丁香酮（AS）浓度
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 转化体系中抗生素与除草剂浓度优化的研究
• 3.3.1.1 不同浓度对农杆菌的抑制
• 3.3.1.2 不同浓度对叶片不定芽分化的影响
• 3.3.1.3 不同浓度对茎段增殖的影响
• 3.3.1.4 不同浓度对组培苗生根的影响
• 3.3.2 影响转化效果的因素的研究
• 3.3.2.1 预培养时间
• 3.3.2.2 菌液侵染时间
• 3.3.2.3 菌液浓度
• 3.3.2.4 共培养时间
• 3.3.2.5 延迟选择
• 3.3.2.6 乙酰丁香酮（AS）浓度
• 3.4 讨论
• 4 转基因植株的分子检测与鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株与质粒
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 转基因植株叶片再分化的Kan和Glu抗性鉴定
• 4.2.2 转基因植株总DNA的大量提取
• 4.2.3 PCR扩增检测
• 4.2.4 Southern-blot分析
• 4.2.4.1 溶液配制
• 4.2.4.2 DIG-DNA探针的制备
• 4.2.4.3 转化植株基因组DNA酶切
• 4.2.4.4 凝胶电泳
• 4.2.4.5 凝胶转膜及固定
• 4.2.4.6 杂交
• 4.2.4.7 洗膜
• 4.2.4.8 显色反应
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 转基因植株叶片再分化能力
• 4.3.2 转基因植株的PCR鉴定
• 4.3.2.1 转反义NtGA20ox基因与转反向重复NtGA20ox基因的PCR鉴定
• 4.3.2.2 转反义pttGA20ox基因与转反向重复pttGA20ox基因的PCR鉴定
• 4.3.3 转基因植株的Southern杂交分析
• 4.3.3.1 转基因烟草AW的Southern杂交分析
• 4.3.3.2 转基因烟草RW的Southern杂交分析
• 4.3.3.3 转基因烟草AG的Southern杂交分析
• 4.3.3.4 转基因烟草RG的Southern杂交分析
• 4.4 讨论
• 5.转基因植株的形态功能变化和激素分析
• 5.1 材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 实验材料和试剂
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 生长测定
• 5.2.1.1 转基因组培苗表型变化测定
• 5.2.1.2 转基因植株移栽方法
• 5.2.1.3 移栽苗生长测定方法及指标
• 5.2.2 切片及细胞学比较
• 5.2.2.1 溶液配制
• 5.2.2.2 石蜡切片法
• 5.2.3 内源激素含量测定
• 5.2.3.1 溶液配制
• 5.2.3.2 激素测定方法
• 5.2.4 喷施外源赤霉素对矮化植株形态的影响
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 转基因组培苗的表型变化
• 5.3.1.1 转基因烟草AW、RW的表型变化
• 5.3.1.2 转基因烟草AG、RG的表型变化
• 5.3.2 转基因植株的移栽
• 5.3.3 移栽苗的生长测定
• 5.3.3.1 转基因烟草AW、RW的生长测定
• 5.3.3.2 转基因烟草AG、RG的生长测定
• 5.3.4 切片及细胞学比较分析
• 5.3.5 内源激素含量测定分析
• 5.3.6 喷施外源赤霉素对矮化植株形态的影响
• 5.4 讨论
• 6 结论
• 图版1
• 图版2
• 图版3
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢