SeNHX1转入大豆的遗传转化及耐盐性研究

论文摘要

在我国耕地面积有限的情况下,开发利用盐碱地,培育耐盐新品种,是一个亟待解决的问题。随着基因工程的发展,植物抗逆分子机制研究的不断深入,利用转基因手段将外源耐盐基因导入植物,以获得高抗盐的转基因植物,已成为当今植物生物技术领域研究的热点之一。本研究首次将耐盐基因SeNHX1通过根癌农杆菌介导的方法转入大豆,以获得高耐盐的抗性植株。由于大豆转基因研究尚未有高效稳定的转化系统,本实验对农杆菌介导的遗传转化体系进行了进一步的探索,确定了一些优化的因子,即消毒剂安替福民与浓盐酸的最佳配比是每一百粒大豆种子用20 ml安替福民和2ml浓盐酸进行灭菌消毒效果最佳,将发芽率提高到了99 %-100 %;选择5 d的无菌苗子叶节为外植体,进行农杆菌侵染,获得的抗性再生苗中嵌合体较少;当农杆菌与子叶节共培养时间为3天时,其平均芽诱导分化率最好,达到40 %;确定了生根培养基为:1/2 MSB + IBA 0.2 mg/L +蔗糖3 % +琼脂0.7 %,pH 5.8;实验共转化外植体1226个,获得12株具有卡那霉素抗性的大豆植株,其中两株获得转基因种子;用CTAB法提取大豆基因组DNA做PCR特异扩增,其中10株均扩增出了目的条带,转化率达到0.8 %以上,这从分子水平上初步证明了耐盐基因SeNHX1已成功整合入大豆基因组中。另外,两粒转基因种子均从生长在培养瓶内的植株获得,这种让组培苗生长在培养瓶开花结实的思路,为大豆遗传转化生根后的移栽操作省去了繁琐的步骤,降低了组培苗的死亡率。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 盐胁迫对植物生长的影响
• 1.2.1 盐分胁迫对种子萌发出苗的影响
• 1.2.2 盐分胁迫对植物生长发育的影响
• 1.2.3 盐胁迫对植物光合作用的影响
• 1.3 植物的盐适应性调节机制
• 1.3.1 细胞内的渗透调节机制
• 1.3.2 细胞内盐的区隔化作用
• +/ H⁺逆向转运蛋白'>1.3.3 Na⁺/ H⁺逆向转运蛋白
• 1.4 耐盐性植物基因工程研究进展
• 1.5 大豆遗传转化系统研究进展
• 1.5.1 农杆菌介导的转化再生体系
• 1.5.2 转基因方法
• 1.5.3 农杆菌介导大豆的遗传转化的主要问题
• 第二章 农杆菌介导的大豆遗传转化体系的优化
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基及培养条件
• 2.1.3 主要仪器和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验流程
• 2.2.2 实验设计
• 2.3 结果讨论
• 2.3.1 外植体质量与消毒剂的比例配比
• 2.3.2 无菌苗的苗龄
• 2.3.3 共培养时间的确定
• 2.3.4 抗性苗生根
• 第三章 农杆菌介导法将S eNHX1 导入大豆的研究
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要设备及试剂
• 3.1.3 质粒和菌株
• 3.2 培养基
• 3.2.1 农杆菌培养基
• 3.2.2 大豆遗传转化培养基
• 3.3 实验设计
• 3.3.1 药剂配制
• 3.3.2 含有目的基因质粒的提取
• 3.3.3 质粒检测
• 3.3.4 农杆菌介导的大豆遗传转化步骤
• 3.4 结果分析
• 3.4.1 质粒检测结果
• 3.4.2 农杆菌介导的大豆遗传转化的不同生长阶段
• 3.5 讨论
• 3.5.1 农杆菌介导大豆遗传转化的主要影响因子
• 3.5.2 大豆组培容易出现的问题及对策
• 第四章 转基因大豆的检测分析
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 酶和试剂盒
• 4.2 方法
• 4.2.1 大豆基因组DNA的小量提取
• 4.2.2 转基因大豆的PCR 检测
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 转基因大豆的PCR检测
• 4.3.2 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢