分枝杆菌甾酮C1，2位脱氢酶的初步研究

论文题目: 分枝杆菌甾酮C1，2位脱氢酶的初步研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物与生化药学

作者: 黄巍

导师: 路福平

关键词: 分枝杆菌,大豆甾醇,甾酮,位脱氢酶,基因敲除

文献来源: 天津科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文研究了分枝杆菌降解大豆甾醇侧链生成AD和ADD的发酵特性。通过分枝杆菌及其细胞裂解液对AD的转化初步研究了分枝杆菌甾酮C1,2位脱氢酶的活性。提取分枝杆菌染色体DNA,设计简并引物,通过PCR扩增得到了甾酮C1,2位脱氢酶基因的部分片段,将其克隆在大肠杆菌中,对目的片段进行序列测定。根据测序结果构建了打靶载体pUC19-MK。将pUC19-MK转化分枝杆菌,筛选正确的阳性转化子。主要研究以下内容: 1.分枝杆菌Mycobacterium sp.M1可以对大豆甾醇进行有效的侧链降解生成AD和ADD,产率约60%,AD和ADD的比率约为1∶5。 2.通过分枝杆菌Mycobacterium sp.M1及其细胞裂解液转化AD直接生成ADD,表明该菌株中含有活力较高的甾酮C1,2位脱氢酶。分枝杆菌细胞裂解液可转化大豆甾醇生成ADD,产率约20%。 3.采用快速小量法提取分枝杆菌Mycobacterium sp.M1的染色体DNA。通过软件AlignX比对已知的简单节杆菌、睾丸酮假单胞菌、混浊红球菌、玫瑰色红球菌、红串红球菌中甾酮C1,2位脱氢酶基因的氨基酸序列和核苷酸序列,根据保守区域设计了一对简并引物,通过PCR扩增得到了分枝杆菌甾酮C1,2位脱氢酶基因的部分片段。 4.将目的片段与pUCm-T载体相连,电转化大肠杆菌JM109,进行测序。根据目的片段的测序结果,将卡那霉素抗性基因插入到目的片段中间,以pUC19为基础构建了打靶载体pUC19-MK。 5.将打靶载体pUC19-MK电转化分枝杆菌Mycobacterium sp.M1,通过卡那霉素抗性初筛转化子。

论文目录:

1 前言

1.1 甾体化合物概述

1.2 甾体激素药物的发展

1.3 甾体边链降解微生物转化反应的特点

1.3.1 底物的溶解性

1.3.2 投料方式的选择

1.3.3 细胞壁膜的阻碍作用

1.4 分枝杆菌降解植物甾醇侧链生产雄甾烯酮

1.4.1 雄甾烯酮AD与ADD的作用意义

1.4.2 微生物降解植物甾醇侧链的作用机理

1.4.3 微生物对甾体母核的降解机理

1.4.4 分枝杆菌降解植物甾醇侧链的转化工艺

1.5 甾体化合物的微生物脱氢反应

1.5.1 催化甾体脱氢转化的微生物

1.5.2 微生物甾体脱氢转化的机理

1.5.3 甾酮C_(1，2)位脱氢酶的研究

1.6 基因敲除

1.6.1 基因敲除概述

1.6.2 基因敲除的基本程序

1.6.3 基因敲除的应用

1.7 分枝杆菌的电转化

1.7.1 电转用感受态细胞的制备

1.7.2 电击转化

1.8 本论文的立项背景

1.9 本论文的研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种及质粒

2.1.2 主要药品

2.1.3 工具酶

2.1.4 抗生素

2.1.5 主要仪器

2.1.6 相关溶液

2.1.7 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 菌种及培养条件

2.2.2 生长曲线的测定

2.2.3 分枝杆菌转化大豆甾醇及AD

2.2.4 发酵液的薄板层析法检测(TLC)

2.2.5 发酵液的高效液相色谱法检测(HPLC)

2.2.6 分枝杆菌细胞裂解液转化大豆甾醇及AD

2.2.7 甾酮C_(1，2)位脱氢酶活力测定方法

2.2.8 分枝杆菌染色体DNA的提取

2.2.9 DNA纯度的测定

2.2.10 琼脂糖凝胶电泳

2.2.11 聚合酶链式反应(PCR)

2.2.12 DNA片段的简单回收

2.2.13 DNA片段的切胶纯化

2.2.14 目的产物与pUCm-T载体的连接

2.2.15 连接产物对大肠杆菌JM109的电转化

2.2.16 重组子的筛选

2.2.17 大肠杆菌中质粒的提取

2.2.18 重组子的PCR鉴定

2.2.19 质粒DNA对分枝杆菌的电击转化

2.2.20 分枝杆菌阳性转化子的筛选

3 结果与讨论

3.1 分枝杆菌M1的斜面培养特性

3.2 分枝杆菌M1生长曲线的测定

3.3 分枝杆菌M1甾酮C_(1，2)位脱氢酶活性的研究

3.3.1 分枝杆菌转化大豆甾醇

3.3.2 分枝杆菌转化AD

3.3.3 分枝杆菌细胞裂解液转化AD

3.3.4 不同生长时期分枝杆菌M1甾酮C_(1，2)位脱氢酶的酶活力测定

3.3.5 分枝杆菌细胞裂解液转化大豆甾醇

3.3.6 小结

3.4 分枝杆菌M1甾酮C_(1，2)位脱氢酶基因敲除的初步研究

3.4.1 分枝杆菌甾酮C_(1，2)位脱氢酶基因部分片断的克隆

3.4.2 分枝杆菌M1甾酮C_(1，2)位脱氢酶基因打靶载体的构建

3.4.3 基因敲除工程菌的筛选

4 结论

5 展望

致谢

参考文献

论文发表情况

附录

附录1 底物大豆甾醇与产物AD、ADD

附录2 甾酮C_(1，2)位脱氢酶基因部分片段序列测定结果

发布时间: 2007-01-10

参考文献

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标签：分枝杆菌论文;  大豆甾醇论文;  甾酮论文;  位脱氢酶论文;  基因敲除论文;