论文题目: 鼠疫耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌比较基因组学研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 军事预防医学
作者: 王效义
导师: 杨瑞馥
关键词: 鼠疫耶尔森氏菌,假结核耶尔森氏菌,抑制消减杂交,芯片
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 鼠疫是由鼠疫菌引起的烈 性传染病,同时鼠疫菌也是一种生物战剂。鼠疫的流行曾给人类带来巨大的灾难。目前,鼠疫虽得到有效控制,但世界卫生组织已将鼠疫列为重新抬头的传染病,并且鼠疫菌生物剂用于生物战和生物恐怖的可能性依然存在。因此,对鼠疫菌进行深入研究具有重要意义。 耶尔森氏菌属包括11个耶尔森氏菌种,其中鼠疫菌、假结核菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌对人致病,其它种对人不致病。鼠疫菌与假结核菌非常近缘,它可能是在1,500-20,000年前由假结核菌株0∶1b进化而来。然而,鼠疫菌引起令人恐怖的鼠疫,而假结核菌仅引起肠道疾病。鼠疫菌比假结核菌多两个毒力质粒,这在一定程度上能解释它与假结核菌之间传播方式的不同。然而,两个毒力质粒的存在不足以解释鼠疫菌的特殊毒力。比较基因组学的方法有望阐明二者之间不同表型的分子机制。目前细菌比较基因组学的方法主要包括全基因组序列测定、全基因组芯片和抑制消减杂交等技术。利用全基因组序列进行比较基因组学研究无疑是最佳选择,但是,测定全基因组序列需要投入大量的人力和物力。细菌的不同生物型和不同分离株基因组之间存在着一定的差异。为比较它们之间的差异,不可能对每一株菌都进行全基因组序列测定,只能选择一些具有代表性的菌株进行。测定,因此这个方法显然不现实。目前已有三株鼠疫菌和一株假结核菌的全基因组序列测定完成,这为我们比较二者之间的差别提供了丰富的信息。另一个比较理想的比较细菌基因组的方法就是全基因组芯片。全基因组芯片要求包括基因组内所有编码序列,这样的工作量和花费的才力也是相当巨大的。抑制消减杂交技术是近几年发展起来的一种比较基因组的方法。它通过对两组基因组DNA进行比较筛选出差异序列,有效抑制相同序列的检出,主要检出差异序列,而且花费的人力和物力相对较低。因此,本研究主要目的是通过抑制削减杂交技术,筛选出假结核菌相对于鼠疫菌的差异序列,制备差异片段DNA芯片,用制备的芯片筛选多株鼠疫菌和假结核菌,希望找到二者之间具有代表性的差异片段,为正确认
论文目录:
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英文摘要
引言
第一章 材料与方法
一.实验材料
(一) 接头和引物序列
(二) 工具酶和DNA分子标准
(三) 试剂盒
(四) 主要试剂
(五) 主要仪器
(六) 常用试剂配制
(七) 实验菌株
二.实验方法
(一) 基因组DNA的提取
(二) 消减杂交实验
1.双链DNA的RsaⅠ酶切
2.酶切效率分析实验
3.酶切片段的纯化
4.接头连接实验
5.接头连接效率分析
6.第一次杂交反应
7.第二次杂交反应
8.第一次PCR反应
9.第二次PCR反应
10.消减效率的PCR分析
11.PCR产物纯化
(三) 抑制消减杂交文库的构建
1.抑制消减杂交基因片段的克隆
2.感受态菌的制备
3.转化实验
4.PCR鉴定阳性克隆
5.第二次筛选阳性克隆
6.细菌的96孔板培养
7.提取质粒
8.质粒的测序
(四) 芯片的制备
1.PCR扩增差异片段
2.差异片段的纯化
3.芯片阳性对照的PCR扩增
4.芯片制备
5.芯片杂交
6.芯片扫描
7.数据分析
第二章 实验结果
一.RsaⅠ酶切结果分析
二.接头连接效率分析结果
三.消减杂交结果分析
四.序列测定和同源性比较分析结果
五.片段序列
六.片段在GenBank中的登入号
七.特异片段功能注释
八.芯片杂交结果
第三章 讨论
结论
参考文献
附录
文献综述
发表文章
致谢
发布时间: 2005-09-05
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