论文摘要
自从第一个蓖麻毒蛋白Ricin得到分离纯化以来,人们已在多种高等植物中发现了核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating protein,RIP）,在真菌和细菌中也有发现。核糖体失活蛋白是一类从高等植物中分离获得的具有抑制核糖体翻译功能的毒蛋白,具有RNA N-糖苷酶活性,可以专一地水解核糖体28S rRNA第A4324位上的腺嘌呤碱基与核糖之间的N-糖苷键,对其产生水解作用,脱去这个腺嘌呤,从而阻遏了延长因子EF-2与核糖体的结合,抑制蛋白质的生物合成。RIPs按结构可分为两种类型:Ⅰ型为单链蛋白,具有RNA N-糖苷酶活性;Ⅱ型RIPs是两条多肽链（A链和B链）通过二硫键结合而成,A链具有RNA N-糖苷酶活性,B链是一个对半乳糖专一的凝集素,可与真核细胞表面的糖蛋白或糖脂的半乳糖部分结合,帮助A链进入细胞内行使功能。随着人们对核糖体失活蛋白的理论研究的深入,它的实际应用也受到了广泛的关注。目前在此方面的研究已涉及到抗病毒、抗真菌、抗昆虫、抗肿瘤及艾滋病的治疗等方面。基于已有的文献研究基础,本研究针对新疆滨藜（Atriplex patens）核糖体失活蛋白基因开展了以下四个方面的工作:首先,采用同源序列克隆基因的方法从新疆滨藜中克隆出核糖体失活蛋白基因（GenBank登录号为GI: DQ991968）。根据GenBank上已发表的各种物种的核糖体失活蛋白基因（rip）序列,分析其保守性并根据保守区设计了六条引物（四条上游引物,两条下游引物）,分别组合经RT-PCR扩增出新疆滨藜核糖体失活蛋白基因（我们将其命名为:Aprip）的核心片段,连接于pMD18-T载体,经DNA序列测定后,结果与GenBank中rip序列进行同源性比较,确定已克隆出的核心片段为Aprip的核心片段,然后通过3′RACE技术获得3′非翻译区序列,再用5′端的保守引物与3′端的特异性引物扩出全长序列。通过序列分析可以发现,ApRIP属Ⅰ型核糖体失活蛋白。通过对Aprip读码框基因序列进行比对,发现Aprip与藜科植物藜的核糖体失活蛋白基因序列的同源性为84%,同源性比较高。但与其它科植物的rip基因相比同源性较低,与葫芦科的天花粉蛋白（TCS）和商陆科的美洲商陆蛋白（PAP）的同源性分别为41%和55%。其次,为了获得基因产物,将Aprip构建到带有麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein,MBP）的原核表达载体pMAL-p2x上,进行融合表达,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白的表达,通过麦芽糖亲和层析柱纯化到了带有目的蛋白的麦芽糖融合蛋白,我们将其命名为:MBP-ApRIP。第三,将Aprip构建到真核表达载体pcDNA3.1上形成重组质粒pcDNA3.1-Aprip,然后用这个质粒作为核酸疫苗做小鼠的尾静脉注射,结果在小鼠的肝脏中检测到了目的基因在mRNA水平的转录。之后又通过注射小鼠的肌肉细胞制备ApRIP多克隆抗体,经过一次MBP-ApRIP融合蛋白加强后,通过ELASA反应和Western-blot分析,结果证明了真核表达载体pcDNA3.1-Aprip可在小鼠体内有效表达,并成功制备了抗血清。第四,对Ap-RIP进行活性检测。为消除麦芽糖融合蛋白MBP-ApRIP中标签蛋白MBP对目的蛋白的影响,我们将Aprip重新构建到只带6个His标签的pET30a原核表达载体中,通过RT-PCR检测可以发现,加入IPTG后,目的基因可以在pET30a载体中有效转录,而且菌的生长速度与对照组相比,受到了抑制,但通过SDS-PAGE检测不到相应的条带,可能是蛋白表达量太低的缘故。另外,我们将Aprip制成不带融合序列的核酸疫苗注射到小鼠肌肉细胞中,经过4次注射后可以观察到小鼠颈部的毛发开始脱落,进食也比对照组有所减少。