柿SSR富集DNA文库构建与筛选

论文题目: 柿SSR富集DNA文库构建与筛选

论文类型: 硕士论文

论文专业: 果树学

作者: 阮小凤

导师: 马锋旺

关键词: 微卫星,磁珠分离,富集文库,筛选

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 柿(Diospyros Kaki Thunb)是我国广泛栽培的果树之一,其面积和产量位于世界第一。柿原产中国,资源丰富,在国际上有一定优势。位于西北农林科技大学的国家柿种质资源圃收集有560多份材料或品种,这些材料中除部分日本甜柿通过杂交育成,谱系及亲缘关系比较清楚外,其他种质遗传背景不清。要想从更深层次上发掘和利用这些资源,就必须找到一个强有力的进行种质分析的工具。分子标记中的微卫星(SSR)分子标记具有多态性丰富,重复性好,共显性等优点,是目前最重要的分子标记之一;但SSR标记必须采用特异性的引物才能进行PCR检测。柿属于柿科柿属,关于柿的SSR标记,即SSR标记的特异性引物目前尚无报道,也没有相近物种的SSR标记可供转移使用,因而必须自己开发引物,而构建SSR富集DNA文库是快速开发SSR引物的基础。 本试验研究首次构建了柿SSR富集DNA文库,创建了适合柿基因组DNA的SSR引物开发体系。其方法是:将柿基因组DNA经酶切后转变成AFLP DNA片段,然后用生物素标记的简单重复序列(SSR)作探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链霉亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,先用对应的AFLP引物扩增,再用pGEM-T Easy Vector体系进行克隆,初步用白色/蓝色克隆表现型进行预选,挑选表现为白色的克隆,构建SSR富集DNA文库。文库的进一步筛选采用Colony PCR技术,避免了使用同位素标记杂交选择。其主要结果是: 1、建立了适合柿基因组DNA提取的改良CTAB法,得到的基因组DNA纯度高、质量好、完整,相对分子量大(Molecular Weight≈21.23kb),通过定量稀释,浓度约为100ng/μl。 2、以柿为材料建立了EcoRI/MseI双内切酶酶切、AFLP预扩增体系, 3、建立了用SSR生物素标记探针与基因组DNA的AFLP片段杂交、用磁珠富集法分离微卫星DNA片段的体系。 4、首次构建了柿SSR富集DNA文库及Colony PCR筛选体系,经测序验证,含SSR的克隆占60%,富集效率较高,说明所构建的SSR富集DNA文库实用、有效。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 文献综述

1.1 分子标记的产生、发展及分类

1.2 常用分子标记技术在园艺作物上的应用进展

1.2.1 RFLP标记

1.2.2 RAPD标记与SCAR标记

1.2.3 AFLP标记

1.2.4 SSR标记

1.2.5 ISSR标记

1.3 SSR标记技术的研究进展

1.3.1 SSR的发现及分类

1.3.2 SSR及各重复单元在植物中的发生频率

1.3.3 传统的SSR标记开发策略

1.3.3.1 基因组文库构建

1.3.3.2 阳性克隆筛选

1.3.3.3 测序及引物设计

1.3.3.4 SSR—PCR扩增检测

1.3.4 采取富集步骤的SSR标记开发策略

1.3.4.1 基于RAPD的开发策略

1.3.4.2 基于ISSR-PCR的SSR分离策略

1.3.4.3 基于引物延伸的SSR分离策略

1.3.4.4 利用选择杂交进行SSR分离

1.3.4.5 公共数据库搜索进行引物设计

1.4 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 Vector和菌株

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 基因组DNA的提取与纯化──改良的CTAB法

2.2.2 DNA样品浓度、纯度的测定

2.2.3 基因组DNA样品限制性内切酶的消化和检测

2.2.4 基因组DNA样品的限制性酶切、DNA片段与接头的连接及预扩增

2.2.5 DNA片段(2000-1000bp)从脂琼糖凝胶的分离、纯化

2.2.6 微卫星DNA片段的杂交筛选(Hybridization)及目标片段的克隆

2.2.7 富集的、假定为微卫星(SSR)AFLP片段的PCR克隆

2.2.8 AFLP目标DNA片段与Vector的连接(T-A克隆)

2.2.9 转化

2.2.10 建库及筛库

2.2.11 重组质粒DNA提取、纯化

2.2.12 重组质粒DNA的酶切鉴定

2.2.13 克隆产物的测序

2.2.14 测序结果分析

第三章 结果与分析

3.1 柿基因组总DNA的提取与质量检测

3.2 基因组DNA的酶切检测

3.3 基因组总DNA的酶切、接头连接、AFLP的扩增结果

3.4 DNA片段扩增产物的回收与克隆

3.5 SSR探针与DNA片段杂交、磁珠回收杂交复合物的结果分析

3.6 SSR富集DNA片段与Vector的连接、重组子向大肠杆菌细胞的转化结果分析

3.7 SSR富集DNA文库的构建及筛选

3.8 阳性克隆质粒DNA提取及酶切检测

第四章 讨论

4.1 影响柿基因组DNA提取质量的因素

4.2 影响微卫星探针(Oligo Probe)杂交效率的因素

4.3 方法的可靠性

致谢

参考文献

作者简介

附录

发布时间: 2007-04-06

参考文献

• [1].基于SSR标记的西瓜DNA指纹图谱库的构建[D]. 范建光.山东农业大学2013
• [2].观赏芍药部分新种质SSR遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建[D]. 季丽静.北京林业大学2013
• [3].莲种质资源遗传多样性研究及DNA指纹图谱构建[D]. 向巧彦.北京林业大学2008
• [4].枇杷（Eriobotrya Lindl）核基因组DNA提取方法的改良及其SSR初步分析[D]. 仲艳.苏州大学2010
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• [6].南瓜SSR反应体系的优化及南瓜无蔓性状分子标记研究[D]. 孟令君.东北林业大学2013
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