论文摘要
子宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一,随着社会生活的变化,人乳头瘤状病毒（human papillomavirus,HPV）感染的增加,宫颈癌发病呈现出明显的年轻化趋势。虽然手术、放疗及化疗的综合治疗已经明显改善了宫颈癌患者的预后,但是晚期宫颈癌及复发癌的治疗仍不尽人意。淋巴道转移是宫颈癌侵袭远处器官的主要途径,也是影响患者预后的至关重要因素。近年来,随着特异性淋巴内皮细胞标志物的出现,肿瘤淋巴管生成的研究成为热点。但由于缺乏相应的淋巴道转移模型,针对宫颈癌淋巴转移的机制研究和治疗措施均难以突破。基因治疗作为治疗恶性肿瘤的一种手段,近年来愈来愈受到人们的重视和关注,其中自杀基因治疗因具有旁观者效应而成为肿瘤基因治疗研究领域中最富有希望的策略之一。胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（cytosine deaminase/5-fluorocytosine,CD/5-FC）系统是目前研究最多的自杀基因系统。Fcy::Fur基因由Fcy和Fur两个基因融合而成,其中,Fcy编码酵母菌胞嘧啶脱氨酶,Fur编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶。与CD基因比,Fcy::Fur基因将5-FC转化为5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）的活性更强。本课题成功构建了免疫功能正常小鼠的宫颈癌淋巴道转移模型并探讨了Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌体外和体内肿瘤模型的影响,为宫颈癌淋巴转移的研究和自杀基因治疗的临床应用提供理论和实验依据。第一章Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌细胞增殖的抑制作用目的:观察Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制作用。方法:应用脂质体介导法以Fcy::Fur基因转染宫颈癌HeLa细胞并给予5-FC处理,进行MTT实验和AO/EB双染实验,观察Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌HeLa细胞的细胞增殖及凋亡的影响。结果:MTT检测显示Fcy::Fur基因转染宫颈癌HeLa细胞联合应用不同浓度的5-FC 24小时后,10mM、1mM、100uM、10uM组的细胞生长抑制率分别为71.23%、48.48%、22.99%、2.94%;72小时后各组的细胞生长抑制率分别为88.39%、64.48%、53.66%和19.97%;120小时后分别为98.74%、74.13%、70.46%和22.24%。AO/EB实验显示加用5-FC后24h、48h和72h的细胞凋亡率分别为15.33%、40%和78.67%。结论:Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌细胞有明显的抑制细胞增殖的作用,并可介导肿瘤细胞的凋亡。第二章宫颈癌淋巴转移模型的建立及Prox-1临床意义初探目的:建立免疫功能正常小鼠的宫颈癌淋巴道转移模型,初步探讨Prox-1的临床意义。方法:将宫颈癌U27瘤株的单细胞悬液注入昆明小鼠左爪垫皮下,观察成瘤率、肿瘤生长及淋巴结转移情况。应用HE染色及CK免疫组化检测各级淋巴结中有无肿瘤转移;应用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和Western blot检测肿瘤组织中VEGFR-3和Prox-1在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果:爪垫种植后成瘤率100%;淋巴结转移程度与接种时间显著相关;荧光定量PCR和Western Blot结果显示,肿瘤组织中Prox-1 mRNA和蛋白在远处淋巴结转移组明显高于前哨淋巴结转移组及无淋巴结转移组,3组两两比较差异有统计学意义（P<0.05）,而VEGFR-3的mRNA和蛋白在前哨淋巴结组与远处淋巴结转移组及无淋巴结转移组分别比较无显著性差异（P>0.05）。结论:昆明小鼠爪垫皮下注射可成功建立宫颈癌淋巴道转移模型,为研究宫颈癌淋巴道转移机制、抗肿瘤淋巴转移治疗提供理想的动物模型;Prox-1是预测肿瘤淋巴结转移及抗肿瘤淋巴转移的敏感指标。第三章Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌淋巴转移小鼠的实验研究第一节Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌淋巴转移小鼠的治疗作用目的:观察Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌的局部生长抑制作用、对淋巴结转移和生存期的影响及其胃肠道副反应。方法:构建宫颈癌U27瘤株的Km小鼠荷瘤模型,分为荷瘤对照组、基因治疗组和5-FU治疗组。观察各组肿瘤体积、重量、倍增时间、生长抑制率、淋巴结转移率、微淋巴管密度、生存期等以及胃肠道副反应。结果: （1）治疗结束时基因治疗组和5-FU组肿瘤体积和重量均小于荷瘤对照组;肿瘤倍增时间较荷瘤对照组明显延长;基因治疗组和5-FU组的肿瘤生长抑制率分别为49.83%和47.51%。（2）治疗结束时荷瘤对照组、基因治疗组和5-FU治疗组小鼠的淋巴结转移率分别为100%、20%和50%;基因治疗组微淋巴管密度（LMVD）较荷瘤对照组明显降低。（3）基因治疗组和5-FU治疗组小鼠生存期较荷瘤对照组明显延长。（4）5-FU治疗组小鼠有明显的胃肠道反应,体重增长缓慢;而基因治疗组与荷瘤对照组比较小鼠体重增长无差异。结论:Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统可抑制宫颈癌肿瘤的生长、减少肿瘤的淋巴结转移、延长小鼠的生存期,无明显胃肠道副反应。第二节Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对宫颈癌淋巴转移小鼠免疫功能的影响目的:观察Fcy::Fur/5-FC基因治疗后荷瘤小鼠脾细胞分泌的Th1/Th2类细胞因子的改变,探讨Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统对机体抗肿瘤免疫功能的影响。方法:建立宫颈癌U27的淋巴道转移模型,分为荷瘤对照组、基因治疗组和5-FU治疗组;另有一组未接种肿瘤细胞的Km小鼠作为正常对照组。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脾淋巴细胞上清液中细胞因子IFN-γ和IL-4的含量,荧光定量聚合酶联反应（FQ-PCR）检测脾淋巴细胞中IFN-γmRNA和IL-4mRNA的表达。结果:ELISA结果显示Fcy::Fur/5-FC基因治疗能明显增强小鼠Th1型细胞因子IFN-γ的分泌,降低Th2型细胞因子IL-4的分泌,从而促使机体从Th2向Th1逆转,有利于提高机体抗肿瘤免疫功能。FQ-PCR结果显示与荷瘤对照组相比,基因治疗组IFN-γmRNA的表达明显增强、而IL-4 mRNA的表达却相对减弱。提示Fcy::Fur/5-FC基因治疗可从基因水平改变机体Th1/Th2类细胞因子的分泌。结论:Fcy::Fur/5-FC自杀基因系统能激活机体抗肿瘤免疫,促使其从Th2向Th1逆转,达到提高机体免疫功能的作用。
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相关论文文献
- [1].融合型自杀基因Fcy∶∶Fur/5-FC对人卵巢癌细胞杀伤作用的研究[J]. 第三军医大学学报 2008(23)
- [2].超声辐照载Fcy::Fur自杀基因微泡治疗卵巢癌移植瘤的实验研究[J]. 激光杂志 2009(03)
- [3].逆转录病毒介导Fcy::Fur融合基因联合5-FC治疗胶质瘤的体内试验研究[J]. 实用临床医药杂志 2009(01)
- [4].含hTERT启动子和Fcy::Fur基因重组质粒的构建及其对卵巢癌细胞的体外杀伤作用[J]. 第三军医大学学报 2009(04)
- [5].Fcy::Fur/5-FC基因治疗对小鼠宫颈癌的体内实验研究[J]. 激光杂志 2009(01)
- [6].逆转录病毒介导Fcy::Fur融合基因联合5-FC治疗裸鼠体内胶质瘤实验研究[J]. 辽宁中医药大学学报 2008(10)
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