以SecA动力泵为靶点的新型抗绿脓杆菌药物筛选模型的建立和应用

论文摘要

三分之一的蛋白质在合成后要被转运到细胞质外才能发挥功能。大多数是通过Sec途径（即分泌途径secretion pathway）进行转运的。其中,最为关键的组分之一是SecA ATP酶,是蛋白质转运途径中的“动力泵”,通过ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜,在细菌中是不可缺少的。我们推测抑制SecA的ATP酶活性的化合物,必然会在一定程度上抑制蛋白质的转运和分泌,这其中也包括细菌生长所必需的一些水解酶类、生长因子、负责物质运输的蛋白质、离子通道蛋白等。SecA是细菌中所特有的,因此它将为我们筛选抗细菌的药物提供一个崭新、低毒的靶点。利用本实验室已构建的高效表达SecA蛋白的基因工程菌,初步建立了SecA蛋白ATP酶活性抑制剂的初筛模型。并对7614个发酵液样品进行了初筛,通过测量抑菌圈,得到对任意一个检定菌有抑菌活性的发酵液样品共计974个（初筛阳性率12.8%）。又经过两次生物学重复,最终得到194个生物学活性较稳定的阳性发酵液样品（阳性率2.5%）。通过阴离子交换方法对工程菌表达产物进行分离纯化,通过考察各种因素对酶活力的影响,优化了以绿脓杆菌SecA N68的ATPase酶活测定体系。利用该方法对五个阳性发酵液样品中的酯相组分进行了酶活抑制的测定,最后研究表明这五个酯相组分对SecA蛋白ATP酶活性均有一定的抑制作用。并对其中特异性作用于绿脓杆菌SecA蛋白的菌种I06A-02818发酵样品进行了活性组分分离纯化的条件的初步摸索。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 实验材料
• 一、菌株
• 二、质粒
• 三、培养基
• 四、主要试剂和试剂盒
• 五、溶液
• 六、分离介质
• 七、主要仪器
• 实验方法
• 一、细胞水平的初筛方法
• 二、PaSecA N68蛋白ATP酶抑制剂筛选方法的建立及优化
• 三、阳性菌株16S rRNA基因序列测定
• 四、微生物来源的SecA蛋白抑制剂的纯化
• 实验结果
• 一、初筛方法的建立
• 二、PaSecA N68蛋白的表达及纯化
• 三、绿脓杆菌SecA N68片段ATP酶活测定方法的优化
• 四、抑制绿脓杆菌SecA的ATPase酶活的测定
• 五、阳性菌株I06A-02818鉴定结果
• 六、阳性菌株I06A-02818的发酵条件及活性成分的初步研究
• 七、发酵液中活性成分的分离纯化
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢