SV40PolyA活化基因元件突变影响GFP报告基因表达

论文摘要

目的:大量非编码序列（non-coding DNA）存在于人和哺乳动物基因组中,大部分非编码序列的功能还不清楚,研究非编码序列对了解基因表达调节的机制、进而探寻非编码序列新的生物学功能对于认识人和哺乳动物的生物学行为,包括分化和衰老,都有重要价值。本研究室的前期工作在猴空泡病毒40（SV40）早期mRNA PolyA序列（SV40PolyA）中发现两个活化基因的原件,即17bp片段: 5′-AAAAAAATGCTTTATTT-3′（实验中实际使用包含17bp片段的22R序列做实验,序列为:5′-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT-3′）和29bp片段:5′-ATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATT-3′,这两个片段均可以解除Alu串连序列（或Line-1重复序列）对GFP报告基因的抑制作用。分析这两个片段发现它们均含有不完整的回文序列,我们将这种活化基因的序列称为不完整回文序列（imperfect palindrome ）,不完整回文序列可以形成不稳定的茎环结构（unstable stem-loop structure）。随着结构基因组学和蛋白组学研究的进展,细胞中的绝大多数成分已经清楚,困扰生物学家的问题（如分化、衰老、表观遗传机理等）可能涉及已知成分的未知功能。本文在我们以前研究工作的基础上做出大胆推测:不完整的DNA回文序列能够形成不稳定的茎环结构,使其在DNA双链状态和各种茎环状态之间不断改变,成为所谓的动态DNA。17bp和29bp片段来自SV40,使用Blast软件,已经查到17bp片段在人和小鼠基因组中广泛存在。一般来说,人和小鼠的细胞不可能为病毒单独提供调控元件,一定是病毒利用了真核细胞中的现有调控机制,所以本研究虽然使用的是病毒DNA元件,但是对认识真核生物的基因表达调节机制依然会有帮助。非编码序列和多种生物学过程有关,已逐渐引起人们的关注。本研究主要通过对22R的突变来研究DNA结构在促进基因表达中的作用。另外,通过不同插入片段质粒的不同剂量的转染,研究GFP基因转染效率的变化。方法:1合成引物和作为模板的DNA片段委托DNA合成公司合成带有适当酶切位点的引物,合成带有不同突变位点或突变部位的DNA片段作为模板。论文的第一部分附表中列出了所使用的人工合成寡核苷酸序列及其名称。2表达载体构建用带有合适酶切位点的引物,PCR扩增目的片段,目的片段包括质粒中的DNA序列和合成的DNA片段,酶切后插入pEGFP-C1质粒,获得插有一个片段的表达载体,利用XbaⅠ/NheⅠ酶切位点可以用T4 DNA连接酶连接,但是连接以后的序列不能被其中的任何一个酶切断的特性制备同向二串联体。3细胞转染和荧光观察将表达载体用LipofectamineTM2000瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下计数观察GFP荧光阳性细胞数。4 Northern杂交用9N随机引物和大肠杆菌DNA聚合酶大片段,将α-32P-dCTP掺入DNA中制备GFP探针。提取转染细胞总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,将RNA转移到尼龙膜上。32P标记的GFP探针杂交、冲洗后通过放射自显影记录实验结果。然后,这种杂交过的尼龙膜用剥离液处理,去除32P-GFP探针,用检测neo RNA的探针再次杂交,放射自显影作为转染效率的对照。5 RT-PCR用TRIzol试剂从转染后的HeLa细胞中提取总RNA,用AMV逆转录酶和9-nt随机引物逆转录,the reaction condition: 50°C 1h,85°C 5min.反应条件为:50°C 1小时,85°C 5分钟,逆转录产物PCR扩增,PCR引物上游为:1GFP1F: 5′-TGAGCCACCGCGCCCAGC-3′;下游为:Alu1R: 5′-TGAGCCACCGCGCCCAGC-3′,PCR条件为:94°C 30秒,50°C 30秒,72°C 1分钟,30个循环,总反应体积25μl。6流式细胞分析委托河北医科大学第四医院完成。结果:1重组表达载体的构建和鉴定因为本研究要在质粒的多克隆部位（MCS）引入NheⅠ酶切位点,所以要去除pEGFP-C1质粒中GFP基因上游的NheⅠ酶切位点,称为“C1去Nhe”。本研究所使用质粒均去除NheⅠ酶切位点。在多克隆位点（MCS）插入Alu14称为C1-Alu14（或pAlu14）,以此为基础再于GFP基因和Alu串联序列之间分别插入待研究的序列,观察对Alu串连序列抑制GFP基因作用的解除作用。重组表达载体经PCR,测序和酶切鉴定证明序列正确后,用于实验研究。2泡的碱基数目影响GFP基因表达22R序列可以折叠成图1（论文第一部分,图1）中的结构,含有一个3nt的loop,两个3bp的茎和一个2nt的泡。本研究为了深入研究22R活化基因的作用机制,将茎环结构泡的碱基数由野生型的2nt,分别突变为4nt和6nt,然后将各个突变片段和野生型片段的二串联体插入到GFP基因和Alu14之间构建表达载体。结果表明,只有当茎环结构泡的碱基数为2nt时,即野生型,序列才具有明显的基因活化作用（论文第一部分,图2 a中泳道1比较泳道4）,其它碱基数目的插入片段活化GFP基因作用不明显（论文第一部分,图2a中泳道2和3比较泳道4）。3泡的碱基类型影响GFP基因表达改变茎环结构泡上的碱基类型（Northern检测连上野生型共做了7个）,将各个突变片段的二串联体或野生型片段插入到GFP基因和Alu14之间构建表达载体并作Northern blot。结果显示,将茎环结构泡上的碱基做突变,只有野生型和4TMI具有明显的基因活化作用（论文第一部分,图3a中泳道1-5比较泳道6和7）。4茎上的碱基类型对基因活化作用的影响对茎环结构茎的碱基类型进行一系列突变,将各个突变片段或野生型片段的二串联体插入GFP基因和Alu14之间构建表达载体并作Northern blot,结果见图4（论文第一部分）。所有突变中,只有4TMI和5AMI活化基因,而且活化基因作用明显高于22R（图4a,b）。又用RT-PCR对Northern结果中的4T和4TMI进行验证,电泳图如图4e,所得结果和Northern结果基本一致。用细胞流式技术和荧光蛋白检测对4T、5A、4TMI和5AMI进行检验,其结果和Northern印记结果基本一致（论文第一部分,图4f,g）。5 MCF-7细胞实验结果为了检验是否在其他细胞中4TMI和5AMI也有活化基因作用,用MCF-7细胞替代HeLa细胞做试验,结果如图5（论文第一部分）所示,4TMI,5AMI活化基因,而且活化基因的作用高于22R,其他序列与pAlu14比较活化基因作用较弱或不明显（论文第一部分图5,泳道3和4比较泳道6）。这些结果与使用HeLa细胞所得到的结果基本一致。6茎环结构互补性影响GFP基因表达根据上述实验,我们推测22R活化基因作用的结构基础是其能够形成适当的茎环结构,此茎环不能过度互补,也不能过度不互补,否则失去活化基因作用。于是,我们做了下述实验:将22R的第17个碱基突变为T（4T）,该序列形成的茎环结构碱基完全互补,失去了泡的结构,与之对应,将22R茎环结构的4-10碱基全突变为T,同时将17碱基也突变为T（7pieT）,或者将14-21碱基全突变为A （7pieA）,茎的所有碱基就都不互补,然后将各个突变片段的二串联体插入GFP基因和Alu14之间构建表达载体并作Northern blot,Northern结果见图6a,显示4T、7pieT和7pieA无明显活化GFP基因作用（论文第一部分,图6a泳道2、4和5比较泳道6）。7 RNA降解实验本文中的试验是基于细胞中RNA的数量,该数量受转录量和降解量的影响。为了排除RNA降解速度不同对本文实验结果的影响,做了RNA降解实验。用RNA合成抑制剂抑制RNA的合成,培养不同时间,提取RNA做Northern杂交试验,结果发现所测定的4个质粒（4T,1AMI ,2AMI,4TMI）,其降解速度没有本质的区别。这个结果说明,本文中所测定出的不同表达载体的GFP基因表达不同,是由于转录水平的原因造成。8 22R序列loop突变对GFP报告基因表达的影响将HeLa细胞用胰酶消化,用DMEM完全培养基配成2×105/ml后加入24孔培养板中,每孔0.5ml,37℃、5% CO2条件下培养24h,用构建的插入loop突变序列的质粒转染,转染量均为0.4μg质粒/2μl脂质体/孔。转染后培养36h,固定细胞用荧光显微镜观察荧光阳性细胞的比例,加上22R共14个不同loop碱基的质粒检测结果见表3（论文第二部分）。Loop的碱基类型显著影响GFP基因表达,AAG、AGA、TGT、TTG和TGC（22R,野生型）这5个质粒促进基因表达作用比较明显（黑色加粗标出）。AAA质粒活化基因的作用最弱。9 22R序列的泡突变对GFP报告基因表达的影响发现有2个质粒,即VECT,VEGT促进基因表达与22R（VEAA,野生型）类似,其荧光阳性率分别为2.70%和1.73（%论文第三部分,表4）。重要的是发现VETA, VETC, VETG和VETT这4个质粒更加明显的促进GFP基因表达,荧光阳性率分别为5.60%,2.96%,12.76%和20.34%（论文第三部分,表4）。这几个具有高度活化GFP基因作用的质粒有一个共同的特点,即均含有“AAATAAA”序列,那么这段序列在活化基因中有什么重要作用呢?我们又构建AA（GTGAAATAAATGCAAATAAAGT）,TT（GTGTTTATTTCTTTATTTGT）,7pieA（GTGAAAAAAATGCAAAAAAAGT）,7pieT（GTGTTTTTTTTGCTTTTTTTGT）序列,插入C1-Alu14质粒的GFP基因和Alu串连序列之间,结果发现,AA序列明显的活化基因（表4,序列号17）,但是活化基因作用低于VETT序列（GTGAAATAAATGCTTTTTTTGT）,看来AAATAAA碱基片段需要和其他序列搭配才可以发挥最好的活化基因作用。10不同细胞浓度对GFP基因表达的影响细胞转染后培养24h或36h,提取RNA做Northern印记检测GFP RNA的表达,结果见图1（论文第三部分）。1A、22R和Alu14不同的细胞浓度转染后培养24h结果说明,2.0×105/ml细胞浓度的转染效率高于1.0×105/ml细胞浓度（论文第三部分,图1泳道1比较泳道2,泳道3比较泳道4,泳道5比较泳道6）。转染后培养36h的结果与培养24h小时的结果类似,（图1泳道7比较泳道8,泳道11比较泳道12,泳道15比较泳道16）。1AMI和4TMI两个质粒转染后培养36h的结果也说明2.0×105/ml细胞浓度的转染效率高于1.0×105/ml细胞浓度（图1泳道9比较泳道10,泳道13比较泳道14）。11转染量在不同的质粒对GFP报告基因表达的影响C1-ORF2转染量在0.8μg时GFP基因表达高于1.2μg（论文第三部分,图3）,该现象在其他质粒表现不如C1-ORF2明显。为了验证该现象,又用C1-ORF2,C1-ORF2as和C1-Alu14三种质粒做类似实验,结果表明,C1-ORF2和C1-ORF2as的表现与C1-Alu14不同（论文第三部分,图4A泳道1-6比较泳道7-9）,C1-Alu14质粒随着转染量的上升GFP基因表达明显提高,而C1-ORF2和C1-ORF2as质粒的GFP基因表达在0.8μg之后提高不显著甚至有下降的趋势。图4B用C1-Alu14as和C1-280-1*14（L1-ORF2序列的第一个280bp同向串连14次插入pEGFP-C1）和C1-280-1*14as做实验,结果是:C1-280-1*14和C1-280-1*14as质粒在0.8μg质粒量时,GFP基因表达比0.4μg质粒的GFP基因表达明显升高,但是1.2μg质粒量比0.8μg质粒量的GFP基因表达升高不明显或有下降趋势（论文第三部分,图4B泳道4-9）;C1-Alu14as随着质粒量的增加呈持续上升,与图4A中C1-Alu14的结果类似。结论:1序列22R的茎环结构中,泡的碱基数为2nt时（野生型）,具有明显的GFP基因活化作用,增加或减少泡的碱基数均使GFP基因活化作用下降。2改变22R茎或泡的碱基类型,发现4TMI和5AMI活化GFP基因。3过度互补和不互补的茎环结构不能活化GFP基因。VEAT（4T）过度互补;7pieA和7pieT无互补,它们均不能活化GFP基因。4 VETA、VETC、VETG和VETT这4个质粒明显促进GFP基因表达,而且AA可以活化基因,说明AAATAAA在活化基因中有重要作用,但是VETT活化GFP基因明显高于其他序列,说明AAATAAA需要与其他序列搭配才可以发挥最大的活化基因作用。5 Loop的碱基类型显著影响GFP基因表达,AAG、AGA、TGT、TTG和TGC（22R,野生型）这5个质粒促进基因表达作用比较明显,AAA质粒活化基因的作用最弱。6转染质粒的种类和剂量及转染细胞浓度影响转染质粒报告基因表达。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 引言
• 第一部分 SV40 PolyA 活化基因片段22R 碱基突变对GFP 报告基因表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 22R 序列loop 和泡突变对GFP 报告基因表达的作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 不同插入片段影响质粒转染条件
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述一 X 染色体失活和等位基因排斥
• 参考文献
• 综述二 病毒基因组茎环结构与病毒生物学功能
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历