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蒙古羊卵巢组织差异表达基因的克隆、筛选、鉴定和特征分析

2020-11-29阅读(401)

蒙古羊卵巢组织差异表达基因的克隆、筛选、鉴定和特征分析

论文摘要

绵羊的多产性状是养羊业获得更多经济效益的重要途径,为研究蒙古羊及国内外绵羊多产性状的分子遗传机理,以蒙古羊为主要研究对象,采用分子标记技术和抑制消减杂交技术（SSH）,从候选基因和差异基因筛选入手,研究蒙古羊和其他绵羊品种产羔性状的遗传多态性,探讨蒙古羊产双羔的形成因素及其分子遗传机理:1、绵羊繁殖性状候选基因的研究应用PCR-SSCP和RFLP技术,以蒙古羊、中国美利奴（科尔沁型）、内蒙古细毛羊、呼伦贝尔羊、萨福克、道塞特和德国肉用美利奴7个绵羊品种共375个样本为实验材料,通过分析BMP15、BMPRIB和GDF9基因共5个位点的遗传多态性,结果表明:（1）国内4个绵羊品种和德国肉用美利奴中均检测到BMP15外显子1的突变,呈现三种基因型,在第28-30位的碱基缺失,导致编码区第10号亮氨酸缺失,形成B1突变体,其它两个品种没有突变;在BMP15基因的B2和B4位点没有检测到突变;（2）中国美利奴羊（科尔沁型）BMPRIB基因编码序列第746位碱基处发生了与Booroola Merino绵羊相同的突变（A746G）,而其它五个绵羊品种没有发生突变;（3）对GDF9基因的G8位点进行了SNP检测,结果在7个绵羊品种中均没有发现突变位点。2、蒙古羊卵巢差异表达基因的筛选和特征分析（1）用抑制性消减杂交技术（SSH）成功构建了经产单、双羔蒙古羊的正反向差减cDNA文库,在两个文库中分别随机挑取了384个克隆。利用PCR技术进行鉴定,分别获得了768个阳性克隆,插入片段长度主要分布在150～1000 bp之间。（2）正、反向消减cDNA作探针对两消减cDNA文库中的阳性克隆进行了筛选。在以经产双羔蒙古羊为Tester、经产单羔蒙古羊为Drive的消减cDNA文库中,利用斑点杂交筛选、测序分析和序列比对,我们揭示了47个差异EST,10个在绵羊中为己知基因,4个未知基因,其中27个与其它物种的基因有较高的同源性（80%以上）,6个未找到明显的同源性。3、影响绵羊排卵全长基因BMP15的克隆与序列分析成功克隆了影响绵羊排卵全长基因BMP15,序列全长6642bp,包括两个外显子和一个内含子,外显子长1182bp,编码393个氨基酸,经序列比对分析,发现蒙古羊和其它物种的BMP15基因的序列同源性很高,而与禽类和鱼类动物之间,同源性较低,20%以上,同时预测了蒙古羊BMP15氨基酸序列的高级结构。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 引言
  • 1.1 绵羊卵泡生长发育动态变化及调控因子
  • 1.1.1 绵羊卵泡的类波（wave-like）模式发育
  • 1.1.2 卵泡生长发育的调控
  • 1.1.3 繁殖相关主要基因的结构与功能
  • 1.2 绵羊分子标记研究进展
  • 1.2.1 限制性片段长度多态性（RFLP）简介
  • 1.2.2 PCR-SSCP 技术
  • 1.3 基因差异表达研究方法
  • 1.3.1 消减杂交法（Subtractive Hybridization）
  • 1.3.2 mRNA 差异显示技术（mRNA Differential Display）
  • 1.3.3 代表性序列差别分析（Representational Difference Analysis）
  • 1.3.4 抑制消减杂交法（Suppression Subtractive Hybridization）
  • 1.3.5 基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression）
  • 1.4 本研究的目的和意义
  • 2 研究一候选基因法研究绵羊的排卵主效基因
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 实验样品
  • 2.1.2 仪器设备
  • 2.1.3 主要试剂和溶液
  • 2.1.4 主要分子生物学软件及相关网站
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 基因组DNA 的提取与检测
  • 2.2.2 PCR 反应
  • 2.2.3 绵羊BMP15、BMPRIB 和GDF9 基因的多态性分析
  • 2.3 数据分析
  • 2.3.1 序列分析
  • 2.3.2 基因多态性的统计方法
  • 2.4 结果与分析
  • 2.4.1 基因组DNA 的提取与检测结果
  • 2.4.2 BMP15 基因的多态性分析
  • 2.4.3 BMPRIB 基因的多态性分析
  • 2.4.4 绵羊GDF9 基因的多态性分析
  • 2.5 讨论
  • 2.5.1 BMP15 基因与绵羊繁殖性能的关系
  • 2.5.2 BMPRIB 基因与绵羊繁殖性能的关系
  • 2.5.3 GDF9 基因与绵羊繁殖性能的关系
  • 2.5.4 关于各基因位点的群体遗传学分析
  • 3 研究二 蒙古羊卵巢组织差异表达基因的筛选和特征分析
  • 3.1 实验样品
  • 3.2 实验试剂
  • 3.3 实验仪器
  • 3.4 载体和菌株
  • 3.5 实验方法
  • 3.5.1 蒙古羊单、双羔卵巢组织总 RNA 的制备
  • 3.5.2 蒙古羊单、双羔卵巢组织mRNA 的分离
  • 3.5.3 Driver 和 Tester cDNA 的制备
  • 3.5.4 cDNA RsaI 酶切
  • 3.5.5 Driver cDNA 的制备
  • 3.5.6 Tester cDNA 的制备——接头连接
  • 3.5.7 差减杂交
  • 3.5.8 差减文库构建
  • 3.5.9 差减cDNA 文库的筛选
  • 3.5.10 阳性克隆cDNA 片段测序及序列分析
  • 3.6 结果分析
  • 3.6.1 蒙古羊卵巢组织总RNA 电泳结果
  • 3.6.2 蒙古羊卵巢组织总RNA 的mRNA 纯化结果
  • 3.6.3 蒙古羊卵巢组织mRNA 的cDNA 电泳结果
  • 3.6.4 抑制消减杂交
  • 3.6.5 消减cDNA 文库的构建和筛选
  • 3.6.6 阳性克隆测序及序列分析
  • 3.6.7 讨论
  • 4 研究三 蒙古羊骨形态发生蛋白基因15 的克隆与序列分析
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 实验样品
  • 4.1.2 主要仪器和设备
  • 4.1.3 主要试剂
  • 4.1.4 主要试剂和溶液的配制
  • 4.1.5 主要分子生物学软件及相关网站
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 基因组DNA 的提取与检测
  • 4.2.2 PCR 反应
  • 4.2.3 蒙古羊 BMP15 基因的克隆与测序
  • 4.3 数据分析
  • 4.4 结果与分析
  • 4.4.1 蒙古羊基因组 DNA 的提取与检测结果
  • 4.4.2 蒙古羊 BMP15 基因的 PCR 扩增结果
  • 4.4.3 扩增产物的克隆及重组质粒的筛选和鉴定
  • 4.4.4 外显子1 和2 引物扩增片断与GenBank 中人BMP15 基因相应片断的比对结果
  • 4.4.5 序列的拼接
  • 4.4.6 蒙古羊BMP15 基因核苷酸序列分析
  • 4.4.7 蒙古羊BMP15 基因编码氨基酸序列分析
  • 4.4.8 蒙古羊BMP15 蛋白结构预测
  • 4.5 讨论
  • 5 结论
  • 本课题主要创新之处
  • 致谢
  • 参考文献
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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