凡纳滨对虾桃拉综合征病毒主要结构蛋白基因的克隆及原核表达

论文摘要

凡纳滨对虾是全球最重要的经济养殖虾品种之一,在世界范围内大量养殖。但其病害也日益严重,对虾病毒病暴发流行给世界对虾养殖业造成巨大经济损失,对海洋资源的可持续发展造成巨大威胁,因此对虾病毒病的研究已成为当前世界虾病研究领域的热点之一。桃拉综合征是最主要的一种影响凡纳滨对虾产量的病毒病,其致死率高达90%以上。桃拉综合征最初仅在南美洲的厄瓜多尔发现,但通过运输感染了病毒的仔虾和亲虾将病毒扩散到美洲,并进一步扩散到全世界。目前,桃拉病毒的诊断方法有组织病理学方法、cDNA探针的原位杂交法、RT-PCR法,但是这些方法均不符合口岸部门快速检疫的要求,因此急需一种快速准确的检疫方法。本研究根据GenBank中桃拉病毒的全基因组序列,分别设计扩增该病毒主要结构蛋白基因vp1、vp2、vp3的相应引物,以发病的凡纳滨对虾中提取的总RNA为模板,利用RT-PCR技术对目的基因进行了扩增,分别获得分子量为1164bp、849bp和507bp的基因片段,片段大小与预期一致。将目的片段与pTA2载体连接,导入大肠杆菌DH5α,获得阳性重组子pTA-vp1、pTA-vp2、pTA-vp3。目的片段测序结果的Blast分析表明已成功获得相关蛋白的基因片段。将此阳性重组子和pET-28a载体分别进行双酶切,构建重组表达载体pET-VP1、pET-VP2和pET-VP3,重组子经酶切和测序鉴定后导入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE电泳的结果表明,在37℃下,0.5mmol/dm3的IPTG诱导表达的重组蛋白均以包涵体的形式存在,重组蛋白VP1、VP2、VP3的大小分别为48KDa、36KDa和24KDa。将重组蛋白复性后用镍柱纯化,将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,Western免疫印迹反应结果表明获得的抗体可与重组蛋白发生特异性反应,Dot-ELISA结果表明获得的抗体可与病虾的病灶发生特异性反应。本研究的结果为研制桃拉病毒快速检测试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1.对虾的主要疾病
• 1.2.对虾的几种主要病毒
• 1.3.桃拉病毒概述
• 1.3.1.桃拉病毒的发现
• 1.3.2.桃拉病毒的地理分布及传播
• 1.3.3.桃拉病毒的分类及基因结构
• 1.3.4.桃拉病毒的宿主范围、年龄和其它感染因素
• 1.3.5.桃拉病毒感染的外部症状
• 1.3.6.诊断方法
• 1.3.6.1.组织学方法
• 1.3.6.2.指示生物测定法
• 1.3.6.3.原位杂交法
• 1.3.6.4.RT-PCR方法
• 1.4.本研究的目的
• 2.材料与方法
• 2.1.材料、试剂
• 2.1.1.菌株和质粒
• 2.1.2.动物材料
• 2.1.3.主要化学试剂及仪器
• 2.2.方法
• 2.2.1.病料采集
• 2.2.2.总RNA的提取
• 2.2.3.第一链cDNA的合成
• 2.2.4.引物设计及合成
• 2.2.5.PCR扩增目的基因
• 2.2.6.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物（酶切片段）
• 2.2.7.PCR产物（酶切片段）的纯化
• 2.2.8.DNA连接反应（TA克隆）
• 2.2.9.大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.10.连接产物转化感受态细胞
• 2.2.11.阳性克隆的筛选
• 2.2.12.质粒的小量提取
• 2.2.13.原核表达载体的构建
• 2.2.14.原核表达载体在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.15.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.16.表达产物的可融性分析
• 2.2.17.包涵体的复性
• 2.2.18.纯化分离表达蛋白
• 2.2.19.免疫小鼠
• 2.2.20.血清处理方法
• 2.2.21.抗血清效价检测
• 2.2.22.Western免疫印迹反应
• 2.2.23.Dot-Elisa检测
• 3.实验结果
• 3.1.RT-PCR扩增vp1、vp2、vp3基因
• 3.2.vp1、vp2、vp3基因测序
• 3.3.vp1、vp2、vp3基因的序列分析
• 3.4.vp1、vp2、vp3基因的TA克隆及鉴定
• 3.5.原核表达载体的构建及鉴定
• 3.6.重组蛋白的表达
• 3.7.重组蛋白的纯化
• 3.8.抗血清效价检测
• 3.9.Western免疫印迹反应
• 3.10.Dot-Elisa检测
• 4.讨论
• 4.1.病料采集
• 4.2.序列分析
• 4.3.载体选择
• 4.4.蛋白表达条件、蛋白纯化及复性的条件优化
• 4.5.蛋白分子量的差异
• 4.6.后续研究展望
• 5.小结
• 6.参考文献
• 致谢