虎纹捕鸟蛛毒素HWTX-XVIIb1空间结构的核磁共振研究

论文摘要

蜘蛛毒素是蜘蛛用来进行防御和捕食猎物的最基本武器。蜘蛛毒素中富含各种可结合不同电压门控离子通道的毒素,这些毒素对不同离子通道的选择性和高亲和性为人们研究离子通道的结构与功能提供了很好的研究手段。对这类毒素进行结构与功能的研究不仅有助于人们了解毒素与离子通道相互作用机制,也有助于人们了解离子通道本身的结构基础,并在此基础上从蜘蛛毒素中寻找和开发相关的药用分子和工具试剂。虎纹捕鸟蛛[ Selenocosmia huwena Wang = Ornithoctonus huwena（Wang）]是近年在我国广西宁明发现的蜘蛛新种,属捕鸟蛛科（Theraphosidae）。因该种蜘蛛体型大,产毒量高且易于饲养,因此成为一种很好的系统研究蜘蛛毒素的材料。虎纹捕鸟蛛毒素-XVIIb1 （HWTX-XVIIb1）是从虎纹捕鸟蛛粗毒中提取、表达、分离纯化的一种新型多肽,它由31个氨基酸残基组成,含8个半胱氨酸。对该毒素进行了全面的电生理检测,发现HWTX-XVIIb1对大鼠DRG细胞的钠离子和钾离子通道没有影响,而对钙离子通道有较强的抑制活性。为了进一步了解HWTX-XVIIb1结构与功能的关系,本文利用二维1H核磁共振（NMR）技术研究了它的空间结构,通过分析水和重水中的DQF-COSY、TOCSY和NOESY谱,识别出HWTX-XVIIb1全部31个氨基酸残基自旋体系;并利用NOESY谱中的dαN、dβN、dNN和dαδ相关完成了序列专一的谱峰归属,从而确认了HWTX-XVIIb1所有的主链质子和几乎所有侧链质子的化学位移。通过分析序列中的NOE相关、3JNH-CαH偶合常数以及H/D质子交换等获得了一系列约束条件,用CNS软件中的模拟退火方法进行计算,得到一组收敛性较好的结构,从中挑选了NOE约束违反小于0.2 ?,二面角约束违反小于2°的20个结构代表HWTX-XVIIb1的空间结构。空间结构研究表明,HWTX-XVIIb1结构中包含一段三链反平行的β-折叠（Met8-Cys9,Cys19-Cys21和Cys28-Cys30）及4个β-转角（Lys4-Glu7,Cys9-Ile12,Cys14-Gly17和Gly24-Arg27）,这些与已经探明结构的其它蜘蛛毒素的结构特点基本相同,为进一步研究钙离子通道与毒素的相互作用奠定了较为坚实的基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 虎纹捕鸟蛛毒素研究综述
• 1.1 虎纹捕鸟蛛毒素的组成
• 1.2 虎纹捕鸟蛛多肽类毒素的结构
• 1.3 虎纹捕鸟蛛毒素的药理学研究
• 1.3.1 作用于电压门控钙，钠离子通道的虎纹捕鸟蛛毒素
• 2+离子通道的虎纹捕鸟蛛毒素'>1.3.1.1 作用于电压门控Ca²⁺离子通道的虎纹捕鸟蛛毒素
• +离子通道的虎纹捕鸟蛛毒素'>1.3.1.2 作用于电压门控Na⁺离子通道的虎纹捕鸟蛛毒素
• 1.3.2 具有其它生物学活性的虎纹捕鸟蛛毒素
• 1.4 虎纹捕鸟蛛多肽类毒素分子结构和功能的关系
• 第二章核磁共振技术研究蛋白质结构综述
• 2.1 蛋白质结构研究方法概述
• 2.1.1 X-射线晶体衍射方法
• 2.1.2 多维核磁共振技术
• 2.1.3 电子显微学方法
• 2.2 核磁共振技术研究蛋白质结构的方法
• 2.2.1 核磁共振研究蛋白质结构的主要特性参数
• 2.2.1.1 化学位移
• 2.2.1.2 J-偶合常数
• 2.2.1.3 弛豫时间
• 2.2.1.4 核Overhauser 效应
• 2.2.2 生物大分子研究中的多维核磁实验
• 2.2.3 基本的二维核磁共振实验
• 2.2.3.1 同核二维谱实验脉冲序列
• 2.2.3.2 异核二维谱实验脉冲序列
• 2.2.4 共振峰指认策略
• 2.2.5 由核磁共振数据构建蛋白质溶液三维结构模型
• 2.3 核磁共振技术研究蛋白质溶液结构的进展与前景
• 第三章虎纹捕鸟蛛毒素HWTX-XVIIb1的结构与功能研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料、试剂和仪器
• 3.2.2 引物设计及PCR 扩增编码成熟肽部分的基因
• 3.2.3 基因的克隆
• 3.2.4 多肽的表达、纯化、脱盐和质谱鉴定
• 3.2.5 HWTX-XVIIb1 对大鼠背根神经节神经元电压门控钙离子通道的影响
• 3.2.6 HWTX-XVIIb1的空间结构研究
• 3.2.6.1 NMR 实验样品的准备
• 3.2.6.2 NMR 实验数据的采集和处理
• 3.3 结果
• 3.3.1 HWTX-XVIIb1 cDNA 序列及编码的氨基酸序列
• 3.3.2 PCR、表达及分离纯化
• 3.3.3 HWTX-XVIIb1 的质谱鉴定
• 3.3.4 HWTX-XVIIb1 的生物学活性
• 3.3.5 HWTX-XVIIb1 的空间结构
• 3.3.5.1 HWTX-XVIIb1 的氢谱谱峰的完全归属
• 3.3.5.2 HWTX-XVIIb1 自旋体系的识别
• 3.3.5.3 HWTX-XVIIb1 序列专一性归属
• 3.3.5.4 结构确定前的二级结构单元分析
• 3.3.5.5 结构计算约束条件
• 3.3.5.5.1 距离约束
• 3.3.5.5.2 二硫键约束
• 3.3.5.5.3 二面角约束
• 3.3.5.6 结构计算
• 3.3.5.7 结构分析与评价
• 3.3.6 结构描述
• 3.3.6.1 主链折叠和二级结构
• 3.3.6.2 氢键网络
• 3.3.6.3 二硫键
• 3.3.6.4 HWTX-XVIIb1 的空间表面结构
• 3.4 讨论
• 3.4.1 HWTX-XVIIb1 空间结构的计算
• 3.4.2 HWTX-XVIIb1 结构与功能的关系
• 3.4.3 NMR 研究HWTX-XVIIb1 溶液结构中的问题
• 3.5 结论及进一步研究设想
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 缩写表
• 致谢