酶膜反应器水解大豆分离蛋白的研究

论文摘要

酶法制备具有生物活性的蛋白水解物及其在食品工业中的应用正受到越来越多的重视。传统的蛋白酶水解方式是采用分批式,然而这种方式存在着很多的缺点。将超滤/纳滤膜技术和水解反应器结合起来,可以实现小分子量水解物从酶解产物中的连续分离,这一方法越来越受到重视。本文将对大豆分离蛋白在酶膜反应器中水解进行研究。首先使用碱性蛋白酶Alcalase 2.4L(EC 3.4.21.62)和中性蛋白酶Protease N(IUB 3.4.24.28)在间歇式反应器中水解大豆分离蛋白(SPI)并对其水解特性进行了研究。结果表明:Protease N具有较高的蛋白酶水解活力,最适作用温度低并且稳定性好,水解过程中易受产物抑制;两种酶水解产物的相对分子质量均小于10,000,游离氨基酸含量较低;Protease N更适合用于酶膜反应器中水解SPI,因此选择Protease N作为后面酶膜反应器的用酶。为获得酶膜反应器中水解SPI的最佳工艺条件,以平均水分通量Javerage、蛋白质回收率Sapparent以及透过液水解度DHpermeate为指标,通过响应面分析方法对初始水分通量Ji ,初始蛋白质浓度[S]和初始蛋白酶浓度[E]/[S]进行了优化。结果表明,三个因素对Javerage、Sapparent和DHpermeate的影响显著,并存在显著差异。经优化后的最优工艺条件为:Ji为10mL/min,[S]为4%(w/v),[E]/[S]为1.5%(w/w),该条件下的Javerage、Sapparent和DHpermeate分别达到71.20%、42.55%和32.35%。为了证实酶膜反应器的作用效果,对水解产物的理化性质和功能性质进行了研究,并使用大孔吸附树脂进行了静态脱盐和乙醇分级洗脱。结果表明:水解产物具有较好的溶解性和较低的粘度,同时具有较好的抗氧化活性。大孔吸附树脂能将水解产物中的盐分完全脱除,使用25%、50%、95%的乙醇溶液进行静态解吸,脱盐率分别为90.72%、92.89%和93.29%,蛋白回收率分别为42.37%、28.16%和15.98%,脱盐后的水解产物的抗氧化活性和ACE抑制活性都得到了增强并随着洗脱乙醇浓度的增加而增加。其中,ACE抑制活性的IC50值由脱盐前的0.418mg/mL降低到95%乙醇洗脱的0.104mg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 大豆蛋白的水解
• 1.3 蛋白质酶法水解的方式
• 1.3.1 间歇式水解
• 1.3.2 固定化酶
• 1.3.3 酶膜反应器（EMR）
• 1.3.4 酶膜反应器存在的问题
• 1.4 大豆多肽的理化性质和生物活性
• 1.5 酶膜法水解大豆分离蛋白的研究现状
• 1.6 立题背景和意义
• 1.7 本论文研究的主要内容
• 第二章 蛋白酶的选择
• 2.1 前言
• 2.2 材料和仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 大豆分离蛋白主要成分测定
• 2.3.2 蛋白质或多肽疏水值的测定
• 2.3.3 SPI 的水解工艺
• 2.3.4 水解度的测定（pH-stat 法）
• 2.3.5 pH-drop 法
• 2.3.6 残余酶活力测定
• 2.3.7 损失酶活力
• 2.3.8 平均膜通量
• 2.3.9 蛋白质回收率
• 2.3.10 相对分子质量分布测定
• 2.3.11 游离氨基酸测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 大豆分离蛋白的主要成分
• 2.4.2 大豆分离蛋白的氨基酸组成和疏水性值
• 2.4.3 蛋白酶水解活力的比较
• 2.4.4 残余酶活力的比较
• 2.4.5 水解产物的特性比较
• 2.4.6 酶膜反应器中水解SPI 的比较
• 2.5 本章小结
• 第三章 酶膜反应器水解SPI 的工艺
• 3.1 前言
• 3.2 试验材料和设备
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 SPI 的水解工艺
• 3.3.2 平均膜通量
• 3.3.3 蛋白质回收率
• 3.3.4 透过液水解度
• 3.3.5 响应面分析设计
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 单因素实验
• 3.4.2 均匀试验设计
• 3.4.3 响应面分析的设计与结果
• 3.5 本章小结
• 第四章 大豆分离蛋白水解产物的脱盐及生物活性研究
• 4.1 前言
• 4.2 试验材料和仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 成分分析
• 4.3.2 SPI 及大豆水解蛋白（SPH）的氨基酸组成
• 4.3.3 SPH 的相对分子质量分布
• 4.3.4 溶解度的测定
• 4.3.5 粘度的测定
• 4.3.6 SPH 的静态脱盐
• 4.3.7 SPH 的体外抗氧化活性研究
• 4.3.8 SPH 的ACE 抑制活性测定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 SPH 的溶解特性
• 4.4.2 SPH 的粘度
• 4.4.3 SPH 的静态脱盐
• 4.4.4 SPH 洗脱组分的相对分子质量分布
• 4.4.5 SPH 洗脱组分的氨基酸组成
• 4.4.6 SPH 体外抗氧化活性研究
• 4.4.7 SPH 的ACE 抑制活性
• 4.5 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文