薄层色谱生物自显影跟踪分离天然乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是造成老年痴呆的最主要原因,是一种进行性和致命性疾病。迄今为止,AD的发病机制尚未明确,但是在众多假说中胆碱能学说和B-淀粉样蛋白学说得到了最广泛的支持。这两种学说都表明乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）和AD的形成密切相关,会从多个方面加重AD患者的症状。目前,抑制AChE活性从而间接增强胆碱能活性仍然是治疗AD最有效的方法。植物中含有许多活性好、毒性低的天然AChE抑制剂（acetylcholinesterase inhibitor,AChEI）,为了准确快速的得到活性单体化合物,本课题对薄层色谱（thin layer chromatography,TLC）生物自显影方法在跟踪分离天然乙酰胆碱酯酶抑制剂方面的应用进行了研究。首先,对现有的TLC生物自显影方法进行了改进和优化,将所用酶溶液的浓度从原方法中的6.67U/mL降低到1.0U/mL,大大降低了实验所需费用。酶用量降低后TLC方法的检测限降低了两个数量级,这对发现植物中微量的AChEI非常有利。此外,对显色背景等进行了优化,使TLC生物自显影方法更适合于在活性成分跟踪分离过程中使用,并建立了排除假阳性结果的实验方法,进一步提高了方法的准确率和结果的可信度。然后,用改进的TLC生物自显影方法结合假阳性排除实验对31种植物提取物进行了抗AChE活性测试,发现荷叶、独活、五味子、徐长卿、香附、细辛、白芍很有可能含有天然AChEI。对荷叶总生物碱提取物进一步分离,得到了一种未被报道过的活性较好的天然AChEI,2-羟基-1-甲氧基阿朴啡,其IC50值为5.3±0.4μM。动力学研究表明,2-羟基-1-甲氧基阿朴啡是AChE的可逆非竞争性抑制剂。三维分子模拟实验表明,它和AChE通过两条氢键形成一个复合体,从而对AChE形成抑制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 AD的发病机制及其治疗药物
• 1.2.1 胆碱能学说
• 1.2.2 Aβ学说
• 1.2.3 氧化应激学说
• 1.2.4 Tau蛋白学说
• 1.2.5 神经血管学说
• 1.2.6 基因学说
• 1.3 乙酰胆碱酯酶和阿尔茨海默病
• 1.3.1 乙酰胆碱酯酶的结构和生物功能
• 1.3.2 乙酰胆碱酯酶和阿尔茨海默病
• 1.4 天然乙酰胆碱酯酶抑制剂
• 1.4.1 石蒜科（Amaryllidaceae）
• 1.4.2 萝藦科（Asclepiadaceae）
• 1.4.3 黄杨科（Buxaceae）
• 1.4.4 藜科（Chenopodiaceae）
• 1.4.5 唇形科（Labiatae）
• 1.4.6 豆科（Leguminosae）
• 1.4.7 石松科（Lycopodiaceae）
• 1.4.8 罂粟科（Papaveraceae）
• 1.4.9 其他各科
• 1.4.10 小结
• 1.5 本课题的研究意义和目的
• 第2章 薄层色谱生物自显影方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 底物和显色剂的选择
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 研究方法
• 2.2.3 结果与讨论
• 2.3 TLC生物自显影方法的改进
• 2.3.1 仪器与试剂
• 2.3.2 实验材料
• 2.3.3 研究方法
• 2.3.4 结果与讨论
• 2.4 小结
• 第3章 植物提取物的抗乙酰胆碱酯酶活性初筛
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 浸膏的制备
• 3.2.3 活性测定
• 3.3 结果与讨论
• 第4章 荷叶的抗乙酰胆碱酯酶活性成分研究
• 4.1 引言
• 4.2 荷叶总生物碱的活性测试
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 结果与讨论
• 4.3 荷叶总生物碱的活性成分研究
• 4.3.1 仪器与试剂
• 4.3.2 实验方法
• 4.3.3 结果与讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A （攻读硕士学位期间所发表的论文）
• 附录B （63种天然AChEI的化学结构式）
• 附录C hy-1、hy-2和hy-3的部分谱图