快速鉴别奶牛乳房炎细菌或真菌的双重PCR方法的建立与应用

论文摘要

奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业最频繁和造成损失最严重的疾病之一,同时也是引起奶牛淘汰的第三大疾病。因其病因复杂,难以防治,所以给奶牛饲养业带来了巨大的经济损失,但至今尚未有彻底解决的办法。因此从安全、经济、高效的角度出发,探索防治奶牛乳房炎的新方法,必将成为今后奶牛乳房炎防治研究的新趋势。奶牛乳房炎一般由细菌引起,但随着抗生素、皮质类固醇激素及免疫抑制剂的大量使用,临床上出现了一种对抗生素治疗无效的顽固性乳房炎。一般情况下,这种乳房炎为真菌性乳房炎,主要病原菌为酵母菌。因此从治疗角度来看,对奶牛乳房炎尤其是真菌性乳房炎的早期鉴别诊断显得尤为重要。因为通过临床症状一般不能准确判断感染的病原菌种类,而且目前奶牛乳房炎的实验室诊断大多仍采用传统的培养法,不仅敏感性较低,而且耗时较长,往往耽误最佳治疗时机。同时细菌和真菌感染采取不同的治疗方案,并且盲目的抗生素治疗只会增加耐药菌株的出现从而导致奶品质下降和治疗困难,所以迫切需要进行新的诊断方法的研究和应用。为探讨、解决以上问题,进行了本项研究。本研究分为三个部分:1、对不同类型乳房炎的细菌学系统分析通过对山东泰安地区3个大型奶牛场奶样进行细菌分离鉴定,从101头奶牛共183个乳样中检出49种共220个菌株,其中葡萄球菌66株,占30%;链球菌25株,占11.4%;其他革兰氏阳性球菌20株,占9%;革兰氏阳性杆菌40株,占18.2%,;革兰氏阴性杆菌46株,占20.9%;真菌23株,占10.5%。而且单纯由一种病原菌引起的乳房炎较少,多数是由2～3种甚至是3种以上的病原菌引起,混合感染率为69.4%。2.奶牛乳房炎葡萄球菌的耐药性调查葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌之一。2006-2007年内采集泰安地区5个规模化奶牛场共80份乳样,进行葡萄球菌的分离,并对其做耐药性调查。用传统的细菌分离方法,细菌培养和生化试验共分离到29株葡萄球菌。其中金黄色葡萄球菌14株（14/29,47.4%）,产色葡萄球菌3株（3/29,10.3%）,木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌都为2株（2/29,6.9%）,头葡萄球菌和模仿葡萄球菌都为1株（1/29,3.3%）;检测耐药性用纸片扩散法,结果为金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌对万古霉素的平均抑菌圈直径分别为19.1mm和20.3mm。葡萄球菌对头孢拉定和阿米卡星都高度敏感,对临床上常用的林可霉素、红霉素、四环素、复合磺胺均存在不同程度的耐药。万古霉素对葡萄球菌具有较强的体外抗菌活性,未发现耐药菌株。3.快速鉴别奶牛乳房炎细菌或真菌的双重PCR方法的建立与应用综合多种细菌、真菌DNA模板的提取方法,摸索出了一套从奶样中同时提取细菌、真菌核酸的新方法。采用β-巯基乙醇裂解细胞壁,利用蜗牛酶和溶菌酶消化细胞壁,再利用石英砂机械破壁。此方法能彻底破坏细菌、真菌细胞壁,提取高质量的DNA。在此基础上,建立双重PCR方法,同时完成对细菌16S rRNA保守区特异性基因片段和真菌18S rRNA保守区特异性基因片段的扩增,快速诊断奶牛乳房炎是细菌感染还是真菌感染或是混合感染。对采自临床型乳房炎和隐性乳房炎共计84个乳样分别用传统细菌学培养法和双重PCR方法对比鉴定。结果表明,双重PCR检测乳样细菌的最小浓度为102CFU/mL,检测乳样真菌的最小浓度为103CFU/mL。双重PCR方法对细菌的检测与平板培养检测方法比较差异不显著（P>0.05）,对真菌的检测与平板培养检测方法比较具有更高的检出率（P<0.01）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 奶牛乳房炎的研究概述
• 1.1 乳房炎的概念及分类
• 1.2 奶牛乳房炎的发生率及危害
• 1.3 奶牛乳房炎的发病原因
• 1.3.1 病原微生物的感染
• 1.3.2 遗传方面的因素
• 1.3.3 环境因素
• 1.3.4 饲养管理因素
• 1.4 奶牛乳房炎常用诊断方法研究进展
• 1.4.1 临床检查
• 1.4.2 体细胞检测
• 1.4.3 乳汁电导率测定法
• 1.4.4 酶检验法
• 1.4.5 牛奶pH值检验
• 1.4.6 PCR法
• 1.4.7 其他检测方法
• 1.5 奶牛乳房炎预防与治疗的研究进展
• 1.5.1 预防措施
• 1.5.2 治疗措施
• 2 本研究的内容、目的及意义
• 试验一 泰安地区部分奶牛场乳房炎病原菌的分离鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 乳样的来源
• 1.1.2 主要试剂、培养基
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌分离培养及形态观察
• 1.2.2 病原菌的鉴定
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 3.1 葡萄球菌仍是引起奶牛乳房炎最重要的致病菌
• 3.2 大肠杆菌和酵母菌是引起奶牛乳房炎的第二大病原菌
• 3.3 平板培养无细菌现象的解释
• 试验二 奶牛乳房炎葡萄球菌常用抗生素及万古霉素耐药性调查
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株来源
• 1.1.2 主要试剂、培养基
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 金黄色葡萄球菌的鉴定
• 1.2.2 葡萄球菌的药物敏感试验
• 2. 结果与分析
• 2.1 PCR 鉴定结果
• 2.2 药物敏感试验
• 2.2.1 金黄色葡萄球菌对12 种常用抗生素的药敏试验结果
• 2.2.2 凝固酶阴性葡萄球菌对12 种常用抗生素的药敏试验结果
• 2.2.3 万古霉素（30ug/片）对葡萄球菌属的药敏结果
• 2.2.4 万古霉素最小抑菌浓度结果
• 3 讨论
• 3.1 治疗本病的有效药物
• 3.2 研究耐万古霉素的金黄色葡萄球菌的重要意义
• 试验三 快速鉴别奶牛乳房炎细菌或真菌的双重PCR方法的建立与应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 参考菌株
• 1.1.2 试验用引物
• 1.1.3 主要试剂、培养基
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 模板的制备
• 1.2.2 乳样中模拟细菌感染临床标本的制备和敏感性检测
• 1.2.3 PCR 扩增产物检测
• 1.2.4 双重 PCR 产物的鉴定
• 2. 结果与分析
• 2.1 细菌通用引物扩增的广谱性试验
• 2.1.1 细菌通用引物扩增葡萄球菌属广谱性试验
• 2.1.2 细菌通用引物扩增链球菌属广谱性试验
• 2.1.3 细菌通用引物扩增其他革兰氏阳性球菌广谱性试验
• 2.1.4 细菌通用引物扩增革兰氏阳性杆菌广谱性试验
• 2.1.5 细菌通用引物扩增革兰氏阴性杆菌广谱性试验
• 2.1.6 真菌通用引物扩增奶样酵母样真菌广谱性试验
• 2.2 双重 PCR 条件的优化
• 2.3 双重 PCR 的特异性检测
• 2.4 双重 PCR 对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌 DNA 的敏感性检测
• 2.5 用双重 PCR 和细菌学培养法对临床样品的检测结果
• 2.6 多重 PCR 产物的测序分析
• 3 讨论
• 3.1 利用细菌和真菌基因组 DNA 的保守序列设计引物检验菌群分类的可行性
• 3.2 利用同一种方法提取细菌、真菌模板的可行性
• 3.3 双重 PCR 方法比传统培养方法敏感、快速、准确
• 结论
• 1. 葡萄球菌、大肠杆菌和酵母菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌
• 2. 治疗由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的有效药物
• 3. 双重PCR方法比传统培养方法敏感、快速、准确
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文