论文摘要
前言幽门螺杆菌（Helibobactor pylori,H.pylori）在人的胃内定植,是引起慢性胃炎的主要原因,并与消化性溃疡、胃癌、B淋巴细胞相关性淋巴瘤的发生密切相关。研究表明,通常H.pylori感染者发生浅表性胃炎很普遍,但只有少数感染者会出现严重的临床结局,如:消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌等。宿主感染细菌的临床结局与细菌毒力因素、宿主反应和环境因素有关。来自于不同个体的Hpylori基因组均包含大约1600个基因,其中大约320个基因为非必需的,100个基因为菌株特异性的。有证据表明,这些遗传学的差别可能影响了H.pylori毒力因子的功能和抗原性,对于产生不同的临床结局具有重要作用,特别是H.pylori致病相关基因,如:cagA,vacA和iceA等的差异,与感染的临床结局密切相关。美国一项研究表明,在动物模型中,感染cagA+菌株的动物更容易发生消化性溃疡,萎缩性胃炎及胃癌等,感染cagA-菌株可以减少胃癌的发生。在欧美一些地区,特殊的vacA slml基因型菌株是致病性的标志,这样的菌株在体外产毒活性高,在体内可以引起严重的上皮细胞损伤。如在哥斯达黎加,感染vacA slb和vacA ml基因型菌株经年龄、性别校正后与胃癌的发生有关。在南非研究发现,感染iceA1型菌株与胃癌的发生有关。由此可见,感染不同基因亚型的H.pylori菌株与产生不同的临床结局密切相关。除了vacA,cag致病基因岛外,其他与疾病相关的多态性位点也可能与胃癌的发生发展有关,如研究发现幽门螺杆菌jhp940位点,以往通过基因型或功能生物学分析认为其无功能,近期许多不同国家研究发现其在与胃癌相关的菌株中出现,由JHP940所诱导的炎性细胞因子在慢性胃炎及胃癌中具有重要作用。由此可见,鉴定菌株特异性基因位点对于了解H.pylori的致病机制、探索不同疾病来源菌株的标志基因、寻找疾病相关性H.pylori治疗靶点意义重大,可以为分析菌株遗传分化关系,建立分子鉴别新体系及分子流行病学研究提供重要基础。目的构建胃癌相关H.pylori差异基因文库并筛选差异基因,期望找到可能与胃癌发生相关的H.pylori基因序列,探讨H.pylori致病基因的疾病相关性,为进一步揭示H.pyIori相关性胃疾病的致病机制、探索疾病相关的细菌菌株的分子标志、寻找疾病相关性H.pylori治疗靶点提供线索和实验依据。方法选取1999-2004在辽宁省庄河地区接受胃镜普查者活检标本355例,男174例,女181例;年龄21～79（平均年龄49.33）岁;沈阳临床胃镜活检标本136例,男69例,女57例;年龄25～78（平均48.61）岁,取新鲜胃粘膜4块,其中3块（胃窦、体、角各1块）进行病理组织学检查,另1块进行H.pylori培养。经中国医科大学伦理委员会批准,以问卷调查或病历记录方法收集所有研究对象的年龄、性别和相关临床资料,并与其签署知情同意书。利用HE染色对所取胃粘膜标本进行组织病理学诊断。采用脑心浸液琼脂培养基对H.pylori进行常规培养。利用常规酚——氯仿方法提取H.pylori菌种DNA。采用PCR法扩增H.pylori cagA、vacAs、vacAm、iceA1和iceA2基因。通过胃癌来源株L301和浅表性胃炎来源株B975之间的抑制消减杂交,构建胃癌来源H.pylori高、低拷贝基因文库。采用斑点杂交、基因测序和blastn同源性分析进一步筛选鉴定胃癌来源H.pylori菌株高、低拷贝基因。采用PCR法扩增筛选出的胃癌来源株高拷贝基因序列。统计分析采用x2验或Fisher’s Exact Test比较计数资料的组间差异。结果1、不同疾病组H.pylori cagA,vacA,iceA基因检测发现GA组感染m2（43.1%）亚型菌株构成比最高,与GU（18.2%）和GC（17.9%）组相比差异有统计学意义（P=0.015,P=0.020）,与GS（30.00%）组相比差异没有统计学意义（P=0.084）。在GA组中,感染slm2亚型菌株有22例（44.9%）,与本组病例中其他基因亚型相比差别均有统计学意义,与GU、GC组感染slm2亚型菌株相比差别有统计学意义（P=0.039）,与GS组相比差别没有统计学意义（P=0.067）。未发现cagA,iceA基因亚型在不同疾病组中存在差别。2、构建了胃癌来源株L301和浅表性胃炎来源株B975差异基因文库。L301高拷贝基因同源性分析结果显示,其主要分为四类,包括:信息的存储和加工、细胞病变和信息传递、复制重组修复和功能未知基因等。L301低拷贝基因同源性分析结果显示,其主要分为五类,包括:核酸转运和代谢、细胞病变和信息传递、代谢、信息的存储和加工、功能未知基因等。3、利用自行设计PCR引物对差异基因之一肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶基因片段进行了扩增,结果发现在19例胃癌来源株中阳性者有10例（52.6%）,在23例浅表性胃炎来源株中未见一例有阳性表达,二者差别有统计学意义（P=0.000）。结论1、辽宁地区感染H.pylori vacAslm2型菌株与萎缩性胃炎发生有关,感染cagA、iceA毒力基因型菌株与胃疾病的发生无明显相关性;2、成功构建了胃癌来源株L301和浅表性胃炎来源株B975差异基因表达文库并筛选鉴定了差异基因,其中包括:信息贮存与加工、细胞突起与信号传递、复制重组与修复、核转运与代谢等几类。其中肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶基因在胃癌来源株为高拷贝基因,其可能为胃癌来源株的特征性基因。