真鲷血浆中卵黄蛋白原的柱后荧光衍生检测及其在环境雌激素生物标志物中的应用

论文摘要

卵黄蛋白原（Vtg）通常只存在于性成熟的雌鱼里,但是当雄鱼或幼鱼暴露于环境雌激素时,其体内也能产生Vtg。因此,Vtg被认为是一种理想的环境雌激素的生物标志物。Vtg的检测方法主要是特异性的免疫分析方法,方法灵敏,选择性强;但耗时长,操作繁琐。因此,建立快速、简便、可靠的Vtg检测方法是深入开展Vtg作为环境雌激素标志物研究的关键前提。目前对Vtg的研究主要集中在淡水鱼类,对海水鱼类的研究较少。随着环境污染的加剧,大量污染物被排入大海,使沿海污染日益严重,因此有必要开展海洋鱼类Vtg的研究,用于监测海洋环境雌激素的污染。本论文选择海鱼真鲷为研究动物,从血浆中纯化获得Vtg的标样;建立了非特异性测定Vtg的分析新方法;并在新方法的基础上,开展真鲷血浆中Vtg作为环境雌激素标志物的研究。本研究的主要内容和结果包括以下几个方面:1.真鲷Vtg的诱导、纯化及初步鉴定采用17β-雌二醇（E2）腹腔注射,使真鲷在7 d内产生大量Vtg;利用阴离子交换（DEAE Sepharose Fast Flow树脂）低压液相色谱系统,一步纯化Vtg。从色谱图和电泳谱图可知,该蛋白只存在于E2诱导后的真鲷血浆中和雌鱼对照血浆中,而不存在于雄鱼对照血浆中,说明该蛋白是雌性特异性蛋白,能够被E2诱导产生。该蛋白经Native-PAGE电泳,结果表明真鲷有两种形式的Vtg,分子量分别为570 kDa和360 kDa;该蛋白经SDS-PAGE后,可形成分子量为180 kDa、115 kDa和70 kDa的3条蛋白带。磷、脂、糖蛋白分析证实,所获取的Vtg是一类含磷、含脂、含糖的大分子蛋白。对真鲷腹腔注射4-壬基酚,发现4-壬基酚也能诱导真鲷体内Vtg的产生。2.柱后荧光衍生-高效液相色谱法测定鱼血浆中的Vtg利用高效阴离子交换Mini Q柱分离和柱后邻苯二甲醛（OPA）荧光衍生,建立了快速测定血浆中Vtg的方法。对柱后衍生反应条件进行了优化,最终确定衍生反应的条件为:衍生液pH值为10.5;衍生液中硼砂浓度为40 mmol/L;OPA浓度为0.4 mg/mL;反应温度为50℃;2-巯基乙醇的浓度为0.5μL/mL。方法的线性

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1.1 环境雌激素
• 1.1.1 环境雌激素的定义
• 1.1.2 环境雌激素的种类和来源
• 1.1.2.1 人工合成的雌激素
• 1.1.2.2 烷基苯酚类化合物
• 1.1.2.3 农药类物质
• 1.1.2.4 二恶英（dioxins）、多氯联苯（PCBs）类
• 1.1.2.5 多环芳烃（PAHs）
• 1.1.2.6 添加剂
• 1.1.2.7 重金属
• 1.1.2.8 天然雌激素
• 1.1.3 环境雌激素的危害
• 1.1.3.1 环境雌激素对野生动物的危害
• 1.1.3.2 环境雌激素对人体健康的危害
• 1.2 环境雌激素的生物标志物
• 1.3 卵黄蛋白原的特性
• 1.3.1 无脊椎动物Vtg 的特性
• 1.3.2 脊椎动物Vtg 的特性
• 1.4 卵黄蛋白原的分离纯化
• 1.4.1 超速离心法
• 1.4.2 沉淀法
• 1.4.3 凝胶渗透色谱法
• 1.4.4 离子交换色谱法
• 1.4.5 金属亲和色谱法
• 1.5 卵黄蛋白原的分析方法
• 1.5.1 特异性分析方法
• 1.5.1.1 放射性免疫分析法（RIA）
• 1.5.1.2 酶联免疫吸附法（ELISA）
• 1.5.1.3 蛋白印迹法
• 1.5.1.4 其它免疫分析方法
• 1.5.2 非特异性分析方法
• 1.5.2.1 间接法
• 1.5.2.2 直接法
• 1.6 Vtg 作为环境雌激素的生物标志物的研究现状
• 1.7 课题的提出
• 1.7.1 立题背景
• 1.7.2 研究目的
• 1.7.3 研究内容和技术途径
• 第一章 参考文献
• 第二章 真鲷 Vtg 的诱导、纯化及初步鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器和试剂
• 2.2.2 实验动物
• 2.2.3 卵黄蛋白原的诱导
• 2.2.4 卵黄蛋白原的分离纯化
• 2+沉淀纯化'>2.2.4.1 EDTA-Mg²⁺沉淀纯化
• 2.2.4.2 Vtg 的色谱分离纯化
• 2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析和生化分析
• 2.2.5.1 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）
• 2.2.5.2 磷蛋白的分析
• 2.2.5.3 脂蛋白的分析
• 2.2.5.4 糖蛋白的分析
• 2.2.5.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 血浆蛋白的色谱分离
• 2.3.2 电泳分析
• 2.3.2.1 Native-PAGE 电泳分析
• 2.3.2.2 SDS-PAGE 电泳分析
• 2.3.3 磷、脂、糖分析
• 2.3.4 4-NP 对真鲷的诱导作用
• 2.4 本章小结
• 第二章 参考文献
• 第三章 柱后荧光衍生－高效液相色谱法测定鱼血浆中的 Vtg
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器和试剂
• 3.2.2 实验动物
• 3.2.3 Vtg 的诱导
• 3.2.4 Vtg 标样的获得
• 3.2.5 色谱分析参数
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 色谱分离
• 3.3.2 荧光检测
• 3.3.3 衍生液中各参数的优化
• 3.3.3.1 衍生液pH 值的影响
• 3.3.3.2 硼砂浓度的影响
• 3.3.3.3 邻苯二甲醛（OPA）浓度的影响
• 3.3.3.4 反应温度的影响
• 3.3.3.5 2-巯基乙醇（MCE）浓度的影响
• 3.3.4 方法的线性范围、测定下限和重现性
• 3.3.5 鱼血浆中Vtg 的测定
• 3.4 本章小结
• 第三章 参考文献
• 第四章 Vtg 作为环境雌激素生物标志物的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器和试剂
• 4.2.2 实验动物
• 4.2.3 污染实验
• 4.2.4 样品预处理
• 4.2.5 血浆中卵黄蛋白原的测定
• 4.2.5.1 流动相
• 4.2.5.2 邻苯二甲醛柱后衍生试剂
• 4.2.5.3 液相色谱参数
• 4.2.6 血浆蛋白总量的测定
• 4.2.7 血浆中性激素水平的测定
• 4.2.8 数据处理
• 4.3 结果与讨论
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼死亡数的影响'>4.3.1 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼死亡数的影响
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼体长、体重及肥满度的影响'>4.3.2 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼体长、体重及肥满度的影响
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆Vtg 含量的影响'>4.3.3 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆Vtg 含量的影响
• 2 对真鲷幼鱼血浆Vtg 含量的影响'>4.3.3.1 EE₂ 对真鲷幼鱼血浆Vtg 含量的影响
• 4.3.3.2 DES 对真鲷幼鱼血浆Vtg 含量的影响
• 4.3.3.3 OP 对真鲷幼鱼血浆Vtg 含量的影响
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼肝胰脏指数（HSI）的影响'>4.3.4 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼肝胰脏指数（HSI）的影响
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆蛋白总量的影响'>4.3.5 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆蛋白总量的影响
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆性激素水平的影响'>4.3.6 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆性激素水平的影响
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆17β-雌二醇（E2）浓度的影响'>4.3.6.1 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆17β-雌二醇（E2）浓度的影响
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆睾酮（T）浓度的影响'>4.3.6.2 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆睾酮（T）浓度的影响
• 2、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆E2/T 比值的影响'>4.3.6.3 EE₂、DES 和OP 对真鲷幼鱼血浆E2/T 比值的影响
• 4.3.7 真鲷幼鱼血浆中Vtg 含量与其它指标的相关性
• 4.4 本章小结
• 第四章 参考文献
• 结语
• 贡献
• 不足之处
• 研究展望
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢