苎麻UDPGDH基因cDNA的克隆及功能分析

论文摘要

苎麻（Boehmeria nivea）在我国有着悠久的栽培历史，是一种重要的纤维作物。为达到纺织要求，必须经过脱胶过程将苎麻韧皮中以果胶、半纤维素、木质素等为代表的胶质成分去除，不仅提高了生产成本，也容易对环境造成显著污染。因此，研究苎麻半纤维素和果胶合成的分子机理，从分子水平改善纤维作物的胶质成分，具有非常重要的理论意义和应用价值。前人的研究表明，尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDPGDH）是半纤维素、果胶合成代谢途径中的关键酶之一。在本研究中，采用现代分子生物学技术，克隆了苎麻UDPGDH全长cDNA；运用植物转基因技术，实现了苎麻UDPGDH基因在异源植株中的表达，并分析了其功能；初步建立了苎麻离体培养体系和遗传转化技术，为苎麻分子育种的深入研究奠定了基础。主要研究结果：根据对已知的UDPGDH基因序列同源性分析，设计简并PCR引物，以由湘苎三号中提取的总RNA反转录所得的cDNA为材料，扩增得到苎麻UDPGDH基因片段，运用RACE技术，获得总长度为1837 bp的UDPGDH全长cDNA序列（Gene Bank No．EF178294），其读码框编码的蛋白质含有480个氨基酸残基。采用生物信息学方法，对所获得的苎麻UDPGDH全长cDNA以及其所编码的蛋白质进行分析，结果表明，该基因及其所编码的蛋白质与已知的多种植物UDPGDH具有高度的同源性，其蛋白质结构中含有UDPGDH所特有的功能性结构域、酶活性部位关键残基及修饰位点，初步说明该基因为苎麻的UDPGDH全长cDNA。将所获得的基因克隆到质粒pET32和pMAL中，在大肠杆菌中表达获得该基因所编码的蛋白质，生物学活性研究表明，该蛋白质具有UDPGDH酶活性，从而证实所获得的基因序列为苎麻UDPGDH全长cDNA序列。为了研究UDPGDH基因的表达和纤维形成的关系，运用RT-PCR技术对苎麻UDPGDH基因在苎麻不同组织中的表达进行了半定量分析。结果表明，在苎麻根、茎、叶、皮中均可以检测到UDPGDH基因的表达，其表达水平按茎、皮、叶、根的顺序呈下降趋势，与上述组织中纤维成分的相对含量呈正相关。运用分子克隆的手段构建了苎麻UDPGDH基因的干扰、反义、正义表达载体，以农杆菌介导将其转化模式植物烟草（WS38），PCR检测结果表明转化阳性率分别达到了100％、90％、70％，证实外源UDPGDH基因片段已经整合到烟草基因组中，酶活性分析同样证实了苎麻UDPGDH基因在转基因植物中的表达。初步的组织学分析表明，反义和干扰表达的转基因植株中，茎段与叶横切面细胞结构较为松散，基本组织细胞间隙增大，而在UDPGDH基因过量表达的转基因植株中则观察到相反的现象，进一步证实UDPGDH基因在苎麻半纤维素和果胶合成中所具有的重要作用。以苎麻叶片为外植体，初步建立了苎麻的离体培养体系。湘苎三号形成优良愈伤组织的较优激素组合为：TDZ 0．3mg／L+2,4-D 0．01-0．03 mg/L，城步青麻为：TDZ 0．45 mg/L+2,4-D 0．03 mg/L、湘苎二号为：TDZ 0．15 mg/L+2,4-D 0．03 mg/L。湘苎三号诱导芽分化较优激素组合为TDZ 1 mg/L+2,4-D 0．1 mg/L，城步青麻品种为TDZ 0．5 mg/L+2,4-D 0．3 mg/L，湘苎二号为TDZ 0．75 mg/L+2,4-D0．3 mg/L。同时采用叶盘法并对苎麻进行了遗传转化，获得了较多的PCR检测阳性苎麻植株。这些工作将为下一步苎麻分子育种研究打下了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 苎麻胶质复合体
• 1.1 果胶多糖的化学组成
• 1.2 半纤维素化学组成与分布
• 2 UDPGDH在生物体中的作用
• 2.1 生物体UDPGDH基因克隆分析
• 2.2 UDPGDH的作用机制
• 2.3 UDPGDH活性的调节
• 3 展望
• 4 立题依据与技术路线
• 第二章 苎麻UDPGDH基因的克隆
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 3 实验结果与分析
• 3.1 苎麻总RNA提取
• 3.2 UDPGDH基因中间片段的克隆
• 3.3 UDPGDH基因3’端序列的克隆
• 3.4 UDPGDH基因5’端序列的克隆
• 3.5 UDPGDH CDNA全长扩增及序列拼接
• 4 讨论
• 第三章 苎麻UDPGDH基因序列分析
• 1 分析方法
• 2 结果
• 2.1 核酸序列分析
• 2.1.1 序列相似性比对
• 2.1.2 序列开放阅读框（ORF）分析
• 2.2 蛋白质序列分析
• 2.2.1 蛋白质性质分析
• 2.2.2 UDPGDH保守区CONSERVED DOMAIN（CD）的分析
• 2.2.3 蛋白质序列跨膜结构预测
• 2.2.4 功能性模体的搜索（PROSITE MOTIF SEARCH）
• 2.2.5 高级结构预测
• 3 讨论
• 第四章 UDPGDH基因组织表达情况的研究（SEMI-QUANTITATIVE RT-PCR）
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 不同组织RNA提取结果
• 3.2 PCR扩增体系的优化
• 3.3 半定量RT-PCR指数扩增循环数次数的确定
• 3.4 苎麻UDPGDH基因在不同组织表达定量的结果
• 4 讨论
• 第五章 苎麻UDPGDH基因原核表达与
• 分析
• 1 材料与方法
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 表达载体PMAL-P2X-UDPGDH的构建流程
• 3.2 UDPGDH目的基因与PMAL-P2X载体双酶切
• 3.3 表达载体PMAL-P2X-UDPGDH的菌落PCR及双酶切检测
• 3.4 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.5 表达载体PET-32A-UDPGDH的构建流程
• 3.6 UDPGDH目的基因与PET-32A载体双酶切
• 3.7 表达载体PET32-A-UDPGDH的菌落PCR及双酶切检测
• 3.8 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.9 UDPGDH融合蛋白酶活性测定
• 4. 讨论
• 第六章 UDPGDH基因植物干扰表达载体的构建及对烟草的转化
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 干扰植物表达载体PFGC5941-UDPGDHS的构建流程
• 3.3 干扰表达载体PFGC5941-UDPGDHS的菌落PCR和酶切检测
• 3.4 干扰表达载体PFGC5941-UDPGDHS转化农杆菌LBA4404的检测
• 3.5 叶盘法转化烟草
• 3.5.1 共培养
• 3.5.2 诱导丛生芽
• 3.5.3 诱导生根
• 3.5.4 移栽
• 3.5.5 烟草PPT抗性梯度试验
• 3.6 干扰转基因烟草的PCR检测
• 3.7 转基因烟草茎部组织切片观察
• 3.8 转基因烟草UDPGDH酶活性检测
• 4 讨论
• 第七章 UDPGDH基因植物反义表达载体的构建及对烟草的转化
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体PWM101-UDPGDH1的构建流程
• 3.2 反义表达载体PWM101-UDPGDH1的菌落PCR和酶切检测
• 3.3 反义表达载体PWM101-UDPGDH1转化农杆菌LBA4404的检测
• 3.4 反义转基因烟草的PCR检测
• 3.5 转基因烟草茎部组织切片观察
• 3.6 转基因烟草UDPGDH酶活性测定
• 4 讨论
• 第八章 UDPGDH基因植物正义表达载体的构建及对烟草的转化
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 正义植物表达载体PWM101-UDPGDH2的构建流程
• 3.2 正义表达载体PWM101-UDPGDH2的菌落PCR和酶切检测
• 3.4 正义表达载体PWM101-UDPGDH2转化农杆菌LBA4404的检测
• 3.5 转基因烟草的分子检测
• 3.6 转基因烟草组织切片观察
• 3.7 转基因烟草UDPGDH酶活性测定
• 4 讨论
• 第九章 苎麻叶片高频植株再生体系的建立及其遗传转化
• 1 材料与方法
• 2 结果分析
• 2.1 不同激素对不同苎麻品种叶片愈伤诱导的影响
• 2.2 不同激素对不同品种叶片不定芽诱导的影响
• 2.3 不同激素浓度对不同品种再生植株生根及移栽的影响
• 2.4 苎麻PPT抗性梯度试验
• 2.5 叶盘法转化苎麻
• 2.6 分子检测
• 3 讨论
• 第十章 结论及研究展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 附录1:缩略词表
• 附录2:主要试剂配置
• 附录3:载体图谱
• 致谢
• 作者简介