温敏性凝胶与海藻糖辅助变性溶菌酶复性的研究

论文摘要

本文研究了聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶（PNIPAAm）和海藻糖促进变性-还原溶菌酶的复性作用。首先研究了凝胶制备的最佳条件和凝胶的物理性质,在确定最适用的凝胶后,考察了各种因素条件下（制胶温度、酶浓度和逐渐升温）凝胶对复性收率的影响;其次,对不同的复性条件下（温度、pH值和盐浓度）海藻糖对溶菌酶的复性作用进行了研究。运用相关动力学模型,对不同浓度的海藻糖和盐酸胍辅助溶菌酶复性的动力学过程进行了深入分析,探讨了海藻糖促进溶菌酶复性的机理。结果表明,以总单体浓度（T）为10%,交联度（C）为5%,制胶温度为22℃制备的PNIPAAm具有最佳的溶胀倍率和缩水倍率,并具有良好的温敏性能。实验选用的PNIPAAm在4℃下溶胀倍率可达16倍以上,而在37℃条件下缩水48h后溶胀倍率仅为0.69倍,且具有良好的溶胀与收缩重复性。利用PNIPAAm的温敏吸放特性,完成对变性酶液在复性过程中的逐渐释放、逐渐折叠,从而达到类似流加操作的复性效果,可有效提高最终复性收率。海藻糖具有促进变性溶菌酶复性的作用;存在最佳的添加浓度使复性收率最高;其最佳操作条件为:pH8-8.5,复性温度35-37℃。利用三级表观动力学方程拟合了不同浓度海藻糖和盐酸胍辅助溶菌酶复性的动力学过程。分析表明,添加海藻糖后可使聚集体生成速率常数KA明显减小,但对复性速率常数KN影响不大;在一定盐酸胍浓度下,随海藻糖浓度的增大,KA先降低后升高,在最佳浓度时KA出现最小值,由于此时KN/KA出现最大值,因此复性收率r最大;在酶浓度不变的条件下,海藻糖辅助复性的最佳浓度随着盐酸胍浓度的增大而增大。这说明海藻糖能够有效抑制蛋白质分子间折叠,防止折叠作用,但不抑制分子内的折叠作用,因此在一定范围内提高其浓度可以促进蛋白质的折叠作用,从而提高复性收率。

论文目录

• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 蛋白质复性的研究现状
• 1.1.1 蛋白质的体外复性方法
• 1.1.2 复性动力学模型
• 1.2 智能高分子凝胶
• 1.2.1 响应“智能”水凝胶
• 1.2.2 水凝胶的合成
• 1.2.3 PNIPAAm 的特性及其对蛋白质复性的辅助功能
• 1.3 海藻糖
• 1.3.1 海藻糖的生产方法
• 1.3.2 海藻糖的生物应用
• 1.3.3 海藻糖的生物保护作用
• 1.4 本论文的研究意义及内容
• 第二章 温敏性凝胶辅助变性溶菌酶复性的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料及设备
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 凝胶的物理性质
• 2.2.2 凝胶辅助变性溶菌酶复性的研究
• 2.3 小结
• 第三章 海藻糖对变性溶菌酶的辅助复性作用及动力学分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料及仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 动力学模型
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 海藻糖对溶菌酶复性的促进作用
• 3.3.2 温度、pH 及盐浓度对海藻糖辅助复性的影响
• 3.3.3 海藻糖及盐酸胍浓度对复性动力学的影响
• 3.4 小结
• 第四章 结论
• 符号表
• 附录
• 参考文献
• 攻读硕士期间取得的研究成果
• 致谢