菠萝蛋白酶的分离及其脱痂作用的研究

论文摘要

菠萝蛋白酶具有良好脱痂作用,在国外临床上已有应用,国内尚未有相关制剂产品。为制备用于烧伤脱痂的菠萝蛋白酶软膏,本课题参考国内外文献,对国产菠萝蛋白酶从精制、各组分溶痂作用、软膏制备及动物活体脱痂方面进行了研究。首先选择国内符合国家药品标准的菠萝蛋白酶原料,对菠萝蛋白酶原料进行了精制,通过单因素法研究原料溶解浓度、pH值和丙酮浓度对精制原料酪蛋白水解活性的影响,确定了最佳精制工艺条件为原料溶解浓度为50 mg╱ml,pH值为4.0,冷丙酮加入浓度为70%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和葡聚糖凝胶SephadexG-75层析结果显示国产菠萝蛋白酶原料与日本产的菠萝蛋白酶原料组分一致。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定菠萝蛋白酶中各组分的分子量分别为27 382、16 131、14 933和10 846。用葡聚糖凝胶SephadexG-75分离收集3个主要组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酪蛋白水解活性测定和体外溶痂实验,结果表明3个组分的酪蛋白水解活性和体外溶痂作用按分子量大小递减。精制原料用葡聚糖凝胶SephadexG-75层析结果表明各组分含量有变化。用PEG4000和PEG400比例为1:3作为基质制备了菠萝蛋白酶软膏,并制定了质量标准。影响因素实验和加速实验表明制备的菠萝蛋白酶软膏稳定性符合要求。以湿润烧伤膏为阳性对照、基质作为阴性对照,研究了精制菠萝蛋白酶原料制备的软膏与未精制原料制备的软膏对豚鼠Ⅲ度烫伤脱痂效果,观察第10天结痂率及平均脱痂天数,结果精制菠萝蛋白酶制备软膏脱痂效果与湿润烧伤膏一致,好于未精制菠萝蛋白酶软膏,两者脱痂效果均好于阴性对照组,脱痂后的病理学切片显示软膏组与阳性对照组没有明显差别。本研究取得的主要研究成果和结论有:（1）对菠萝蛋白酶原料进行了精制,制定了最佳精制工艺条件。（2）对菠萝蛋白酶分离出的主要组分进行了体外溶痂研究,研究了不同组分的溶痂效果。（3）研究了菠萝蛋白酶的软膏制剂工艺,并制定了质量标准。（4）对菠萝蛋白酶软膏进行了豚鼠Ⅲ度烫伤脱痂研究,证明了其良好的脱痂效果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 理化性质
• 1.2 生产方法简介
• 1.3 药理作用
• 1.3.1 抑制血小板聚集、溶解纤维蛋白、抗炎作用
• 1.3.2 用于烧伤后脱痂
• 1.3.2.1 烧伤简介
• 1.3.2.2 菠萝蛋白酶脱痂作用
• 1.3.3 抗癌作用
• 1.3.4 对免疫细胞的调节作用
• 1.3.5 增强抗生素效应
• 1.3.6 在外伤方面的应用
• 1.4 药动力学与毒理学研究
• 1.5 本课题的研究目的及内容
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 菠萝蛋白酶原料精制
• 2.1 菠萝蛋白酶原料的质量检查
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 药品与试剂
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.4 实验结果
• 2.2 菠萝蛋白酶原料精制
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 药品与试剂
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 硫酸铵沉淀法
• 2.2.3.2 丙酮沉淀法
• 2.2.3.3 效价测定
• 2.2.4 实验结果
• 2.3 丙酮法精制菠萝蛋白酶工艺研究
• 2.3.1 仪器
• 2.3.2 药品与试剂
• 2.3.3 实验方法
• 2.3.3.1 原料溶解浓度
• 2.3.3.2 pH值
• 2.3.3.3 丙酮浓度
• 2.3.4 实验结果
• 2.3.4.1 原料溶解浓度
• 2.3.4.2 pH值
• 2.3.4.3 丙酮浓度
• 2.4 讨论
• 第三章 菠萝蛋白酶分离与体外溶痂研究
• 3.1 菠萝蛋白酶的分离
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 药品与试剂
• 3.1.3 试验方法
• 3.1.3.1 原料的组分分离
• 3.1.3.2 效价测定
• 3.1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.1.4 试验结果
• 3.1.4.1 凝胶层析结果
• 3.1.4.2 效价测定结果
• 3.1.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
• 3.2 体外溶痂试验
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 药品与材料
• 3.2.3 试验方法
• 3.2.4 试验结果
• 3.3 讨论
• 第四章 菠萝蛋白酶软膏的制备及质量控制
• 4.1 材料
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 药品与试剂
• 4.2 软膏的制备
• 4.2.1 处方筛选
• 4.2.2 处方筛选结果
• 4.3 质量控制
• 4.3.1 样品
• 4.3.2 性状
• 4.3.3 鉴别
• 4.3.3.1 鉴别方法
• 4.3.3.2 辅料影响
• 4.3.4 检查
• 4.3.4.1 粒度
• 4.3.4.2 装量
• 4.3.4.3 无菌
• 4.3.5 效价测定
• 4.3.5.1 回收率试验
• 4.3.5.2 精密度试验
• 4.3.5.3 样品测定结果
• 4.4 稳定性考察
• 4.4.1 影响因素试验
• 4.4.1.1 高温试验
• 4.4.1.2 光照试验
• 4.4.1.3 考察结果
• 4.4.2 加速试验及结果
• 4.5 讨论
• 4.5.1 主药含量的选择
• 4.5.2 软膏基质的选择
• 4.5.3 灭菌与无菌操作
• 4.5.4 关于效价测定
• 4.5.5 质量控制
• 第五章 菠萝蛋白酶软膏的脱痂作用研究
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 统计学处理
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 动物模型的制备
• 5.2.2 脱痂试验
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 第10天的结痂面积
• 5.3.2 脱痂时间
• 5.3.3 病理学检查
• 5.4 讨论
• 5.4.1 烧烫伤模型的制备
• 5.4.2 用药方法对药效的影响
• 5.4.3 药物浓度的探讨
• 5.4.4 药物不良反应
• 本课题的创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表文章目录
• 学位论文评阅及答辩情况表