猫α和ω干扰素的原核表达及抗病毒活性测定

论文摘要

干扰素（IFN）是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子,在特定的诱生剂作用下,通过细胞基因组控制产生的一类糖蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调控等多种生物学活性。干扰素具体可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型。Ⅰ型干扰素具有抗病毒和抗肿瘤作用,直接影响到人类和动物病毒病的免疫防治等,具有广阔的临床应用前景。相较于传统诱导淋巴细胞产生的天然干扰素,基因工程干扰素的生物学活性与其高度相似,其优点还有产品质量稳定、纯度高、质量易于控制、便于规模化生产等。并且大规模生产使其生产成本大大降低,对其在现代宠物行业中的推广与使用十分有利。本研究利用基因工程技术和蛋白质工程技术制备出猫α和ω干扰素的重组蛋白并研究其抗病毒活性,为今后更深层次的临床研究打下了坚实的理论基础,为新型有效的动物抗病毒药物的发现以及高效的基因工程干扰素制品的构建提供了研究手段和理论依据。根据GeneBank上收录的猫α和ω干扰素基因序列,检测其信号肽部分并去除,得到编码成熟蛋白的序列,依照大肠杆菌密码子的兼并性及密码子的偏好性,以不改变氨基酸排列顺序和组成为前提,改造已知的基因序列,用大肠杆菌偏好的密码子替换原有的密码子,得到新的编码猫α和ω干扰素的基因序列,长度分别为510bp和525bp,之后在序列两端添加BamHⅠ和 Hind Ⅱ的酶切位点,送生物公司进行全基因合成,并连接至原核表达载体pET-32a中,得到两个重组原核表达质粒pET32a-FeIFN-α和pET32a-FeIFN-ω,转化宿主菌BL21（DE3）感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,两个重组质粒均得到了高效表达,融合蛋白的分子质量均在33kD左右,以包涵体的形式存在。经过菌体破碎、包涵体的洗涤、溶解变性和透析复性后得到了较纯的重组猫α和ω干扰素。本研究采用微量细胞病变抑制法测定重组融合蛋白的抗病毒活性,结果如下：（1）利用非洲绿猴肾细胞细胞测定,重组猫α干扰素抗VSV活性为4.7×1O3U/mL,蛋白浓度为0.96mg/mL,比活性为4.9×103U/mg;利用猫肾细胞细胞测定,重组猫a干扰素抗VSV活性为4.7×107U/mL,蛋白浓度为0.96mg/mL比活性为4.9×107U/mg。（2）利用非洲绿猴肾细胞测定,重组猫ω干扰素抗VSV活性为1.78×104 U/mL,蛋白浓度为0.84 mg/mL,比活性为2.12×104 U/mg;利用猫肾细胞测定,重组猫ω干扰素抗VSV活性为3.7×105U/mL,蛋白浓度为0.84mg/mL,比活性为4.4×105 U/mg。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 干扰素研究概述
• 1 干扰素的发现
• 2 干扰素的分类及基本性质
• 3 干扰素的产生
• 4 干扰素的分子结构
• 5 干扰素受体及其分布
• 5.1 干扰素受体
• 5.2 干扰素受体的分布
• 6 干扰素的生物学功能及其机制
• 6.1 干扰素抗病毒作用及机制
• 6.2 干扰素抗肿瘤作用及机制
• 6.3 干扰素免疫调节作用及机制
• 6.4 干扰素控制细胞凋亡及机制
• 6.5 干扰素的免疫佐剂作用
• 6.6 干扰素的其他作用
• 7 干扰素的研究进展
• 8 干扰素的应用
• 8.1 干扰素在人医上的应用
• 8.2 干扰素在畜牧兽医上的应用
• 9 小结
• 参考文献
• 第二篇 试验部分
• 第一章 猫α和ω干扰素全基因合成及原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 试验用质粒与菌株
• 1.2 主要试剂与仪器
• 1.2.1 表达重组干扰素相关试剂
• 1.2.2 主要仪器设备和耗材
• 1.3 试验用溶液配制
• 1.4 重组干扰素基因的设计与合成
• 1.5 重组干扰素蛋白的原核表达
• 1.5.1 重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21
• 1.5.2 质粒提取
• 1.5.3 重组质粒酶切鉴定
• 1.5.4 重组质粒测序鉴定
• 1.5.5 干扰素的诱导表达及鉴定
• 1.5.6 大肠杆菌表达的猫α和ω干扰素的可溶性鉴定
• 1.6 重组干扰素的大量表达
• 1.6.1 菌体破碎及包涵体提取
• 1.6.2 包涵体的洗涤及变性
• 1.6.3 目的蛋白透析复性
• 2 结果与分析
• 2.1 优化后的猫α和ω干扰素基因序列
• 2.2 重组菌诱导表达产物鉴定
• 2.3 超声裂解后上清和包涵体电泳分析
• 2.4 重组蛋白纯化后SDS-PAGE分析
• 3 讨论
• 3.1 研究意义
• 3.2 表达系统的选择
• 3.3 包涵体的形成及纯化
• 3.4 蛋白复性
• 参考文献
• 第二章 猫α和ω干扰素抗病毒活性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验用细胞及病毒
• 1.2 试剂
• 1.3 重组猫α干扰素抗VSV活性测定
• 1.3.1 细胞复苏
• 1.3.2 水疱性口炎病毒（VSV）的扩增与保存
• 1.3.3 病毒效价滴定
• 1.3.4 重组猫α干扰素在Vero上抗VSV活性测定
• 1.3.5 重组猫α干扰素在F81上抗VSV活性测定
• 1.4 重组猫ω干扰素抗VSV活性测定
• 1.4.1 水疱性口炎病毒（VSV）的扩增与保存
• 1.4.2 病毒效价滴定
• 1.4.3 重组猫ω干扰素在Vero上抗VSV活性测定
• 1.4.4 重组猫ω干扰素在F81上抗VSV活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 VSV的TCID5o测定
• 50测定'>2.1.1 Vero上VSV的增殖与TCID₅₀测定
• 50测定'>2.1.2 F81上VSV的增殖与TCID₅₀测定
• 2.2 重组猫α干扰素抗VSV活性测定结果
• 2.2.1 Vero细胞上α干扰素活性的测定
• 2.2.2 F81细胞上α干扰素活性的测定
• 2.3 重组猫ω干扰素抗VSV活性测定结果
• 2.3.1 Vero细胞上ω干扰素活性的测定
• 2.3.2 F81细胞上ω干扰素活性的测定
• 3 讨论
• 3.1 重组干扰素抗病毒活性的测定
• 3.2 重组猫α干扰素生物学活性测定
• 3.3 重组猫ω干扰素生物学活性测定
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢