论文题目: 利用基因打靶制备生产人血清白蛋白转基因猪的初步研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 细胞生物学
作者: 孙世惠
导师: 邓继先
关键词: 猪血清白蛋白基因,噬菌斑原位杂交,基因打靶,体细胞核移植
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 人血清白蛋白(HSA)是一种含585个氨基酸的单链、无糖基化可溶性单体蛋白,分子量为66-69KDa,在血浆中含量丰富并在生理及医疗中发挥重要功能。但由于来源有限且易受病原微生物的污染,因而借助转基因动物生产人血清白蛋白是一很好途径。本试验对人血清白蛋白基因定位整合入猪血清白蛋白基因位点及打靶细胞的核移植进行了研究,最终目的是希望从转基因猪的血液中获得重组人血清白蛋白,为人血清白蛋白来源提供有效途径。在此选择猪生产人血清白蛋白是基于猪血容量大,易饲养,其白蛋白与人的同源性高等特点;而且避免许多人源性病源因子的污染;此外,利用基因打靶技术实现利用猪天然蛋白调控序列调控HSA的表达,排除了“位置效应”的影响,使人血清白蛋白能够稳定表达。 本研究首先克隆了猪血清白蛋白基因35kb,对基因序列进行分析并对其上游调控序列转录功能进行了初步探讨,发现猪血清白蛋白基因第一内含子序列与人的同源性高;-7.2 kb范围内与-1.3kb范围内的远端调控序列在细胞水平上对目的蛋白的表达差别不大。由于neo对目的基因的表达存在一定影响,因此本研究首先构建了利用白蛋白基因5′和3′调控序列指导绿色荧光蛋白表达的载体pEXp11,探讨了正筛选标记neo基因插入内含子中是否能随着基因的转录而被剪切掉,研究发现neo基因在转录过程中能被有效切除,此研究为优化打靶载体构建方法提供资料。在此基础上以人血清白蛋白基因cDNA为目的基因,构建了带有正负筛选标记的置换型基因打靶载体,并转化猪胎儿成纤维细胞,获得抗药性克隆并进行PCR和Southern鉴定,最终获得3个发生同源重组的细胞克隆。以此细胞株作为核供体,体外发育成熟的去核猪卵母细胞作为核受体,进行体细胞核移植。采用电融合和化学激活的方法获得56枚重构胚,14.3%发育到4-细胞胚。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
第一章 猪血清白蛋白基因的克隆及其调控序列转录功能分析
第一节 猪血清白蛋白基因的克隆及序列分析
第二节 猪血清白蛋白基因5′调控区转录功能分析
第二章 基因打靶载体的构建
第一节 载体中正筛选标记基因neo在翻译中的剪切研究
第二节 基因打靶载体的构建
第三章 猪胎儿成纤维细胞基因打靶及体细胞核移植研究
第一节 猪胎儿成纤维细胞基因打靶及中靶克隆的筛选
第二节 猪血清白蛋白基因打靶体细胞的核移植
研究总结
博士在读期间发表文章
致谢
附录发表文章
综述：提高转基因表达水平的策略
猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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