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H5亚型流感病毒血凝素（H5 HA）特异性单克隆抗体库的构建及H5 HA抗原性变异规律研究

2020-11-24阅读(614)

H5亚型流感病毒血凝素（H5 HA）特异性单克隆抗体库的构建及H5 HA抗原性变异规律研究

论文摘要

2003年至今,东南亚国家持续爆发H5N1禽流感疫情并随着候鸟迁移不断向亚洲、欧洲和非洲国家扩散传播,各国养禽业因此遭受灭顶之灾,同时不断引发的人感染事件也给各国公共卫生工作带来严峻挑战。流感病毒由于变异迅速,不断有新的病毒株出现,导致了对其监控、预防以及治疗存在巨大困难。目前对H5亚型禽流感病毒的变异规律研究是当前流感病毒研究的一个热点,对分析病毒的变异趋势,预测全球流感大流行有重要意义。本研究的目的是建立一个抗H5亚型流感病毒HA蛋白特异性单克隆抗体库,并利用该单抗库试图分析H5亚型流感病毒HA蛋白抗原变异规律。首先在本实验室已有研究基础上,采用A/Ck/HK/Yu22/02（H5N1）作为免疫原,获得了114株针对H5亚型流感病毒血凝素（H5 HA）特异性单克隆抗体,构建一个H5单抗库。其次,运用分子进化分析手段分析了近年来东南亚各国流行的H5N1病毒株,挑选出33株能基本覆盖目前世界主要流行株的变异类型的H5亚型禽流感病毒株作为H5单抗库的评估病毒株。第三,运用评估病毒株与单抗库进行血凝抑制试验（HI）分析,发现H5亚型禽流感病毒HA蛋白中的10个表位聚集区,分别被10种不同的单抗类型（M1-M10）所识别区分。基于114株H5单抗的HI反应谱,挑选其中的16株代表单抗株进行中和试验（NT）分析,发现H5亚型禽流感病毒HA蛋白中的四个不同的中和表位聚集区,分别被4类中和单抗（N1-N4）所识别。第四,基于H5单抗与33株H5亚型禽流感病毒株的血凝抑制试验图谱和中和图谱,开创了一种新的H5N1禽流感病毒抗原性变异分析方法,发现当前流行的H5N1病毒株呈现如下变异规律:（1）H5N1病毒正处于高度变异期,存在八种变异亚系（A-H）共存的流行现状;（2）不同H5N1病毒变异株中存在一个共有的保守表位;（3）H5N1病毒的变异规律存在明显的地域差别。同时利用H5中和单抗panel分析H5N1疫苗候选株的抗原性差别,为今后H5N1禽流感疫苗株的筛选和评价提供一种新方法。第五,对广谱单抗8H5做进一步的鉴定和分析,发现8H5对提高H5本实验室早期建立的H5亚型流感病毒诊断试剂的检测灵敏度有显著效果。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  • 一、甲型流感病毒的生物学特性
  • 1. 流感病毒的分类与命名
  • 2. 病毒的形态与结构
  • 3. 甲型流感病毒基因组和主要蛋白的功能
  • 4. 流感病毒的复制周期
  • 5. 病毒颗粒的化学组成
  • 6. 病毒对理化因素的抵抗力
  • 二、甲型流感病毒的进化
  • 1. 流感病毒的宿主
  • 2. 流感病毒的基因变异规律
  • 3. 流感病毒进化现象的分析
  • 4. 流感病毒进化分析的要点
  • 三、 H5N1 病毒的传播
  • 1. H5N1 病毒传播的分析
  • 2. H5N1 禽流感病毒在人间爆发流行可能性
  • 四、流感病毒的特异性诊断
  • 1. 传统流感诊断方法
  • 2. 分子诊断
  • 3. 快速诊断方法
  • 4. H5 亚型禽流感病毒的快速诊断
  • 五、H5 亚型流感病毒的预防及治疗
  • 1. 流感病毒的疫苗研究
  • 2. 病毒感染的治疗药物
  • 六、本论文的研究目的、思路和意义
  • 1. 研究目的与思路
  • 2. 研究意义
  • 第二章 材料与方法
  • 一、材料
  • 1. 主要仪器
  • 2. 主要试剂与材料
  • 3. 常用溶液和培养基的配制
  • 二、方法
  • 1. 基因克隆的构建
  • 2. 流感病毒滴度的血凝测定（Hemagglutination Unit Assay，HAU）
  • 3. 流感病毒的血凝抑制实验
  • 4. 代表性流感病毒株的进化分析
  • 5. 免疫用流感病毒的大量制备
  • 6. H5 单抗的制备
  • 7. H5 单抗的性质鉴定及评估
  • 8. 酶联免疫吸附分析（ELISA）
  • 第三章 结果与分析
  • 一、单抗的筛选
  • 二、单抗评估病毒株的选择
  • 三、单抗库的鉴定
  • 1. 单抗的血凝抑制试验鉴定（HI）
  • 2. 单抗的中和实验评价
  • 3. 单抗库的基本评价
  • 四、H5 亚型流感病毒血凝素蛋白的抗原性变异分析
  • 1. H5N1 流行病毒株HA抗原性变异分析
  • 2. 候选疫苗株的抗原性变异分析
  • 五、广谱单抗8H5 的鉴定
  • 1. 免疫杂交实验
  • 2. 间接免疫荧光
  • 3. 单抗8H5对不同H5N1禽流感病毒的血凝抑制活性
  • 4. 单抗8H5 对不同H5N1 禽流感病毒的中和活性
  • 5. 单抗8H5 在双抗体夹心ELISA中的应用
  • 第四章 讨论
  • 一、病毒株的选择
  • 二、单抗库的特点
  • 1. 广谱反应性抗体系列
  • 2. 抗体反应类型的整体趋势
  • 3. 特殊抗体的分析
  • 4. 单抗库的应用
  • 三、H5 亚型流感病毒血凝素蛋白抗原变异性
  • 1. H5 亚型流感病毒的分类
  • 2. H5 亚型流感病毒血凝素蛋白抗原变异性规律
  • 四、广谱单抗8H5
  • 1. 单抗8H5 的基本评价
  • 2. 单抗8H5 在H5 亚型流感病毒特异性检测试剂研究上的作用
  • 3. 单抗8H5 在H5 亚型流感病毒疫苗研究和感染后治疗中的应用潜力
  • 小结
  • 展望
  • 参考文献
  • 硕士期间发表文章
  • 致谢

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